铜绿假单胞菌在低营养静态环境中的长期适应性进化：毒力特征与表型可塑性的重塑

本研究通过实验进化模型揭示了机会性人类病原体铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）在低营养（1% HL5）静态环境中长期（12周）培养后的适应性变化。研究发现，进化菌株表现出代时缩短、细胞尺寸减小、绿脓菌素（pyocyanin）产量增加、生物被膜形成减少及运动性（motility）丧失等核心表型转变。尤为重要的是，部分进化菌株对吞噬性捕食者（Acanthamoeba castellanii）的毒力/竞争力显著增强。该工作为预测医院及家居环境中病原体的进化轨迹、理解非生物条件对宿主-病原体互作的影响提供了关键见解。

　　

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种具有多重耐药性的机会性人类病原体，能够在多种自然和人为环境中生存。它是囊性纤维化（Cystic Fibrosis）患者发病的主要致病菌，也是美国医院内感染中最普遍的病原体之一。研究表明，该微生物可以在低营养环境（如排水管）中存活并持续存在。然而，适应此类环境如何影响该微生物的表型特征尚未得到充分研究。

本研究实施了一个实验进化系统，将六株铜绿假单胞菌（四株临床分离株，两株环境分离株）在低营养条件下连续培养12周，并评估其因适应此类环境而发生的表型和基因型变化。

材料与方法

实验选用六株铜绿假单胞菌，基于其菌落表型、绿脓素（pyocin）谱和分离来源进行选择。菌株在静态、低营养培养基（1% HL5）中于室温（22°C）下培养。每2-3天更换一次培养基，每7天通过刮取附着的细胞进行传代。在整个实验过程中，通过菌落PCR检测绿脓素生物合成基因以确保无交叉污染。在12周的时间内，每个菌株进化出三个生物学重复谱系。

对祖先菌株和12周进化分离株的一系列表型进行了评估，包括在1% HL5培养基中22°C和37°C下的代时计算、通过显微镜和ImageJ软件测量细胞长度、通过结晶紫染色法定量生物被膜生物量、通过分光光度法测量绿脓菌素（pyocyanin，OD₆₈₆）和绿脓菌荧光素（pyoverdine，荧光395_ex/460_em）产量、通过穿刺接种0.3% LB琼脂评估游动 motility，以及与吞噬性捕食者棘阿米巴（Acanthamoeba castellanii）的共培养实验以评估毒力/竞争力变化。此外，对四个菌株（B80398, B80427, 17-047, 17-055）的祖先和一个进化谱系进行了基因组测序，并与参考基因组（P. aeruginosa UCBPP-PA14）进行比对，以识别单核苷酸多态性（SNPs）。

结果

细菌生长随时间的变化

进化实验通常会导致进化谱系与其祖先相比适应度增加。代时减少是适应度增加的指标之一。在22°C下，大多数进化分离株（来自B80427、PA3和17-047菌株）显示出比其祖先更短的代时，表明它们适应了实验进化条件。在37°C下，B84725、PA3和17-055菌株的大多数进化分离株也显示出代时减少。生长曲线分析显示，在22°C下，进化谱系与祖先之间存在许多显著差异，但在37°C下差异较小，表明进化过程中发生的遗传变化主要优化了在室温下的生长。

细胞长度的分布

细胞大小与代谢适应度相关，较小的表面积与体积比有利于营养物质扩散。在22°C下，许多进化分离株的细胞长度相对于祖先有所减少，但PA3的所有进化谱系细胞长度均增加。在37°C下，细胞长度的差异大多不显著，但B84725的所有进化谱系细胞长度减少。总体而言，细胞大小的变化因菌株和谱系而异，并未观察到强烈的定向选择压力。

生物被膜形成

出乎意料的是，与选择附着细胞的实验设计假设相反，只有两个菌株（PA B80398和PA3）的进化谱系表现出比其祖先显著减少的生物被膜生物量。其余四个菌株的进化谱系与祖先相比无显著差异。分析表明，生物被膜形成受到培养天数、菌株本身以及菌株与天数、实验进化之间存在复杂的交互作用的影响，但实验进化本身没有直接的全局性效应。这可能是由于在低营养条件下合成胞外多糖基质成本高昂，进化菌株可能转向其他更经济的附着机制。

个体分子表型

绿脓菌素（pyocyanin）是一种次级代谢产物，可在低氧和低营养环境中稳定氧化还原状态并作为电子传递链的最终电子受体。假设进化谱系会产生更多绿脓菌素。结果支持了这一假设：三个菌株（PA B80427、SRP 17-047和SRP 17-055）的进化谱系绿脓菌素产量显著增加。然而，PA3的所有进化谱系产量显著减少，表明该性状的选择压力存在菌株特异性。

绿脓菌荧光素（pyoverdine）是一种铁载体。在所使用的1% HL5培养基中，铁含量可能并非限制因素。结果与之一致：六个测试菌株中有五个的绿脓菌荧光素产量未发生显著变化，只有一个环境分离株SRP 17-047的一个进化谱系产量显著降低。这表明绿脓菌荧光素在实验进化条件下既未被强烈选择，也未被强烈淘汰。

游动 motility（swimming motility）的评估显示，在实验开始时具有高运动性的菌株（B80398, PA3, 17-047, 17-055）的几乎所有进化谱系，其运动性均显著降低。而祖先本身运动性就较弱或缺乏运动性的菌株（B80427, B84725）则变化不大。对较早时间点分离株的测试表明，运动性的丧失发生在进化过程的不同周数（17-047在第2周，17-055在第3周，PA3在第5周，B80398在第7周）。这表明在低营养静态环境中，运动性是被强烈选择的性状，但其丧失的时间和程度因菌株而异。

宿主相关表型在低营养环境进化过程中的变化

与吞噬性捕食者棘阿米巴（Acanthamoeba castellanii）的共培养实验用于评估进化对毒力/竞争力的影响。经过16天的共培养后，与临床分离株B80398和PA3的进化谱系共培养的棘阿米巴滋养体（trophozoite）存活数量显著低于与其祖先共培养的数量。其他菌株的结果则因变异较大而未达到统计学显著性。所有铜绿假单胞菌分离株（祖先和进化谱系）均能在共培养中存活16天，除PA3的进化谱系存活细胞数量显著高于祖先外，其他菌株的进化谱系与祖先在存活数量上无显著差异。运动性降低可能导致被阿米巴识别的鞭毛蛋白减少，这可能是进化谱系导致捕食者生存率降低的一个潜在机制。

进化谱系与祖先相比的基因组变化

对四个菌株（B83098, B80427, 17-047, 17-055）的祖先和一个进化谱系进行的基因组测序和变异分析发现，编码区SNPs数量在212至312个之间。在所有四个进化谱系中均发生突变的基因有六个，编码：吩嗪生物合成蛋白PhzA2/PhzA1（与绿脓菌素合成相关）、VI型分泌系统尖端蛋白VgrG/VgrG1、短链脱氢酶、外膜蛋白OprM、谷氨酸5-激酶（参与尿素循环）以及3-羧基-顺,顺-粘康酸环异构酶（原儿茶酸途径的一部分）。此外，一些与推定的毒力因子（如VirS转录调控因子、TpsA/B双组分分泌系统蛋白）和组氨酸生物合成相关的基因在三个菌株中发生突变。在运动性显著降低的菌株中，仅B80398在已知的鞭毛相关蛋白FliR基因中发现SNPs，另外三个菌株（B80398, B80427, 17-047）在参与碳水化合物代谢和鞭毛运动调控的转录因子DmlR基因中发现SNPs。这表明运动性丧失的遗传基础可能复杂，涉及调控区域或其他未知基因的变化。

讨论

在低营养条件下长期培养铜绿假单胞菌导致其与适应度和/或毒力相关的多种表型发生改变。一些变化在大多数进化谱系中共享，包括代时缩短、细胞尺寸减小、绿脓菌素产量增加和运动性降低，表明这些表型改变可能是在低营养环境中提高适应度的常见策略。而生物被膜形成和绿脓菌荧光素产量的变化则因菌株和谱系而异，表明这些性状在实验系统中的选择压力较弱或存在多种进化路径。

实验进化系统预期会选择增强的生物被膜形成，但结果却相反，这可能是由于在营养限制下，合成胞外基质成本过高，进化倾向于更经济的附着方式。运动性的降低与选择 against 浮游细胞的设计一致。绿脓菌素产量的增加可能与其在低氧/低营养条件下作为电子受体的代谢功能有关。绿脓菌荧光素产量的稳定则暗示培养基中的铁含量可能并非限制因子。

共培养实验表明，适应低营养环境可能导致对吞噬性捕食者的毒力增强，这暗示了此类进化可能对宿主-病原体相互作用产生影响。基因组分析揭示了在进化谱系中存在的突变平行性（mutational parallelism），即不同菌株在相同基因上独立地获得了突变，这为理解低营养适应的遗传基础提供了线索。

总之，这项研究揭示了铜绿假单胞菌在低营养环境中进化的高度可塑性和复杂性。这些发现对于预测该病原体在医院和家庭环境（如排水管、医疗器械）中的持久性和进化方向、理解其毒力进化机制以及改进感染治疗策略具有重要意义。未来的研究可以在此基础上，进一步探索在捕食者存在下，营养浓度对宿主-病原体共进化的影响。