金黄色葡萄球菌编码四种差异调控的丙酮酸转运蛋白：揭示其代谢适应性的新机制

本综述系统阐述了金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）利用四种差异调控的丙酮酸转运蛋白（LrgAB, LctP, LldP, MonT）以适应不同环境条件的最新发现。研究通过遗传学、14C-丙酮酸摄取实验及生长表型分析，证实这些转运蛋白在能量代谢（如TCA循环）和致病性中扮演关键角色，填补了我们对病原菌代谢网络（如碳分解代谢物抑制，Carbon Catabolite Repression, CCR）认知的空白，为靶向代谢通路的抗感染策略提供了新视角。

　　

ABSTRACT

金黄色葡萄球菌作为病原体的成功，部分归因于其利用感染期间可用的多种营养源的能力。其成功的关键在于涉及丙酮酸的途径，这些途径是能量生产、氧化代谢和生物合成过程的枢纽。当可用时，细菌从环境中获取丙酮酸以促进生长。最近，LrgAB被确定为微氧条件下的丙酮酸转运蛋白，这使我们推测金黄色葡萄球菌编码其他在需氧生长期间活跃的丙酮酸转运蛋白。在这项研究中，我们使用毒性丙酮酸类似物3-氟丙酮酸（3-FP）来分离丙酮酸摄取受损的突变体。这些突变体的全基因组测序（WGS）揭示了两个基因lctP和lldP的突变。当lctP和lldP均失活时，丙酮酸摄取显著延迟。尽管LldP和LctP被注释为L-乳酸通透酶，但¹⁴C-丙酮酸摄取实验证实它们作为丙酮酸转运蛋白发挥作用。尽管丙酮酸摄取减少，但lctP lldP突变体在含有丙酮酸的培养基中没有生长缺陷，表明可能存在额外的丙酮酸输入蛋白。对lctP lldP突变体的3-FP敏感性重新评估揭示了一个抑制圈，证实存在另一个转运蛋白。3-FP抗性lldP lctP突变体的WGS将B7H15_13955（一个注释的MFS转运蛋白）确定为第四个转运蛋白。重要的是，所有四个基因的失活完全消除了丙酮酸摄取，表明我们已经确定了所有的丙酮酸转运蛋白。这些发现揭示了金黄色葡萄球菌采用多种丙酮酸转运蛋白来支持需氧和厌氧条件下的丙酮酸代谢。

IMPORTANCE

丙酮酸是一种关键代谢物，在许多条件下支持细菌的能量生产。虽然LrgAB系统先前被涉及在微氧条件下导入丙酮酸，但在需氧生长期间使金黄色葡萄球菌获取丙酮酸的转运蛋白仍未明确。我们确定了lctP和lldP（两个注释为乳酸转运蛋白的基因）以及B7H15_13955作为额外的丙酮酸转运蛋白。通过遗传失活、丙酮酸消耗、生长和¹⁴C-丙酮酸摄取实验，我们证明LctP、LldP和B7H15_13955能够导入丙酮酸，并且与LrgAB一起构成了一个受调控的丙酮酸获取网络。这一发现填补了我们对金黄色葡萄球菌代谢适应性理解的一个关键空白，并揭示了这种病原体配备了多种系统以在不同环境条件下导入丙酮酸。

INTRODUCTION

丙酮酸代谢是细菌适应性和存活的关键决定因素，因为它在维持需氧和厌氧条件下的细胞稳态和能量生产中起着关键作用。它是中心代谢的关键中间体，并作为氧化代谢、溢出代谢物生产以及脂肪酸和氨基酸生物合成的碳分配点发挥着关键作用。作为多种代谢途径中的关键中间体，从周围环境获取这种分子是一种重要的替代能源。

大多数原核生物丙酮酸导入的研究都集中在模式生物大肠杆菌（Escherichia coli）上，它编码三种丙酮酸转运蛋白，包括一种可诱导的、高亲和力的丙酮酸/H⁺同向转运蛋白BtsT，一种组成型丙酮酸转运蛋白CstA，和YhjX。CstA最初被表征为肽转运蛋白，直到进一步的研究证明cstA失活导致丙酮酸摄取减少。此外，研究表明btsT的失活导致丙酮酸摄取减少。正如预期的那样，cstA和btsT的同时失活导致丙酮酸摄取更显著的减少，证明了这些转运蛋白在获取这种代谢物方面的叠加效应。

虽然最著名的是其作为细胞死亡效应物的作用，但最近对几种细菌物种中lrgAB操纵子的研究揭示了其参与丙酮酸摄取，表明Cid/Lrg蛋白家族在围绕丙酮酸节点的代谢中发挥着未被表征的作用。在金黄色葡萄球菌中，破坏lrgAB操纵子导致在低氧条件下以丙酮酸作为主要碳源生长时出现显著的生长缺陷，这与丙酮酸消耗减少相关。鉴于lrgAB突变体在以丙酮酸作为碳源的需氧条件下生长与亲本株相当，我们假设金黄色葡萄球菌编码额外的转运蛋白，能够在这些条件下介导丙酮酸摄取。

在这项研究中，我们确定了另外三个基因（lctP、lldP和B7H15_13955）参与金黄色葡萄球菌的丙酮酸摄取。尽管被注释为乳酸转运蛋白，我们能够证明LctP和LldP在需氧生长期间参与丙酮酸导入，但不参与乳酸导入。此外，我们的结果证明了这些转运蛋白的冗余性和差异调控，并在二次抑制筛选中揭示了B7H15_13955作为丙酮酸转运蛋白的存在，调控数据表明这种新发现的丙酮酸输入蛋白受到碳分解代谢物抑制。

RESULTS

Inactivating mutations in lctP and lldP confer resistance to a toxic pyruvate analog

最近的研究表明，lrgAB操纵子在微氧条件下以丙酮酸作为主要碳源时，在丙酮酸的获取中起着重要作用。为了识别在需氧条件下参与丙酮酸获取的基因，我们利用一种毒性丙酮酸类似物3-氟丙酮酸（3-FP）来选择基因突变，例如丙酮酸特异性转运蛋白，这些突变赋予对3-FP的抗性。将金黄色葡萄球菌实验室菌株JE2涂布在胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）平板表面，然后将饱和有3-FP的圆片放在每个平板的中心。在37°C培养过夜后，在产生的清除区中出现的菌落被分离出来，并随后测试对3-FP的抗性。在液体培养中确认3-FP抗性后，对四个JE2突变体进行全基因组测序（WGS），以识别可能与抗性表型相关的任何突变。如表1所示，每个抗性菌株在推定的L-乳酸通透酶lctP中都有一个移码突变，导致产生301个氨基酸的截短蛋白产物，而野生型为530个氨基酸。此外，四个抗性菌株中有三个在第二个推定的L-乳酸通透酶lldP中有独特的导致其失活的突变，表明金黄色葡萄球菌可能编码两个额外的丙酮酸转运蛋白。

LctP and LldP are important for pyruvate consumption during aerobic growth

因为我们发现多个3-FP抗性菌株在lldP和lctP中都有突变，我们构建了一个双突变体（lctP/lldP）以确定这些基因是否具有冗余功能。为了评估这些突变对丙酮酸导入的影响，我们在生长过程中测量了外源丙酮酸的浓度。为此，我们在标准TSB（含有0.25%葡萄糖（14 mM），此处称为TSBG）中培养JE2和推定的丙酮酸突变体菌株，并补充丙酮酸（0.5 mM），并按照Endres等人描述的方法测定细胞外丙酮酸浓度。单独失活lctP和lldP导致外源丙酮酸消耗与野生型菌株相比有最小但可重复的减少，但同时失活lctP和lldP导致丙酮酸消耗延迟。此外，我们将lrgAB突变引入lctP/lldP突变体，产生一个三重突变体（Δ3），所有推定的转运蛋白均失活。有趣的是，三重突变体在生长4小时和6小时后培养基中的丙酮酸浓度增加，表明它可能无法导入丙酮酸，甚至可能将丙酮酸输出到培养基中。总之，这些数据表明LldP和LctP对于从培养基中摄取丙酮酸很重要。此外，三重突变体在生长后期丙酮酸浓度高出5倍的观察结果表明，丙酮酸的导入和输出是由不同的转运蛋白介导的。

The lctP and lldP genes encode pyruvate transporters

我们观察到lctP/lldP和Δ3突变体中外源丙酮酸水平显著升高，表明这三种蛋白质影响丙酮酸导入。为了提供LctP、LldP和/或LrgAB能够转运丙酮酸的直接证据，我们利用¹⁴C-丙酮酸摄取实验来评估这种代谢物导入细胞的情况。简而言之，菌株在含有0.5 mM丙酮酸的TSBG中生长四小时，与图2中监测外源丙酮酸水平的条件相同。洗涤细胞后，将大约10⁸个细胞与最终浓度为0.5 mM丙酮酸的¹⁴C-丙酮酸一起孵育，并在10分钟的时间过程中取样。如图3A和B所示，与野生型菌株相比，lctP lldP双突变体相关的丙酮酸水平显著降低。然而，所有三个基因座都被破坏的Δ3菌株导致细胞摄取的¹⁴C-丙酮酸水平几乎检测不到，表明其在这些条件下将丙酮酸转运入细胞的能力几乎完全丧失。为了确定三种丙酮酸转运蛋白的相对贡献，我们评估了Δ3突变体分别用镉诱导型启动子控制下的每个推定的丙酮酸转运蛋白进行互补后的¹⁴C-丙酮酸摄取。这些实验的结果表明，所有三种推定的丙酮酸转运蛋白都有助于丙酮酸导入，其中lctP在这些条件下作用最显著，其次是lldP，然后是lrgAB。

因为lctP和lldP被注释为乳酸通透酶，我们试图评估这些转运蛋白对丙酮酸的特异性。为此，我们在过量（5 mM）冷丙酮酸或乳酸存在下，使用野生型JE2菌株进行了相同的¹⁴C-丙酮酸摄取实验。正如预期的那样，冷丙酮酸的存在显著降低了¹⁴C-丙酮酸的摄取。相反，未标记的过量乳酸的存在对标记丙酮酸的摄取影响最小，表明由这三个丙酮酸转运基因座编码的转运蛋白不是测试条件下乳酸摄取的重要贡献者。

S. aureus encodes a fourth pyruvate transporter

由于在Δ3突变体中观察到¹⁴C-丙酮酸导入显著减少，我们假设在补充丙酮酸作为额外碳源的培养基中需氧生长时，我们会观察到生长产量下降。在化学限定培养基（CDM）中进行了需氧生长曲线实验，培养基分别补充了葡萄糖（CDMG；14 mM）、丙酮酸（CDMP；28 mM）或乳酸（CDML；28 mM）。令人惊讶的是，在所有测试条件下，与野生型菌株相比，我们没有观察到生长产量下降，尽管在所有未补充额外碳源的CDM中的菌株都观察到显著的生长产量下降。这表明培养基中存在的其他碳源（即氨基酸）可能掩盖了这些突变对生长的潜在影响，或者存在一个额外的丙酮酸转运蛋白能够在这些条件下导入丙酮酸。

为了检验存在另一个转运蛋白的假设，我们试图确认lldP/lctP和Δ3突变体确实对毒性丙酮酸类似物3-FP完全抗性。令人惊讶的是，当将饱和有3-FP的圆片放在生长在TSBG上的lctP/lldP菌苔上时，我们观察到了一个抑制圈，尽管比在野生型菌株中观察到的小，表明存在另一个转运蛋白。我们还测试了Δ3突变体对3-FP的敏感性，发现它也有一个抑制圈，尽管略显模糊，支持了确实存在一个额外的、第四个丙酮酸转运蛋白的假设。从抑制圈中，我们分离了在lctP/lldP和Δ3突变体的3-FP饱和圆片附近生长的单个菌落。我们通过观察到生长直至3-FP饱和圆片来确认这些菌落对3-FP具有抗性。两个3-FP抗性lctP/lldP菌株和一个Δ3菌株的WGS揭示了一个注释的MFS转运蛋白（B7H15_13955）中独特的SNP或失活缺失。

S. aureus encodes four pyruvate transporters

因为我们在三个测序的3-FP抗性菌株中观察到B7H15_13955的独特突变，我们将B7H15_13955突变引入Δ3菌株，产生一个四重突变体（Δ4；lctP/lctP/lrgAB/13955），并评估在补充丙酮酸的CDM中的生长。Δ4突变体在补充丙酮酸的CDM中表现出生长产量降低，类似于野生型菌株在CDM中的生长。这些数据表明我们已经确定了金黄色葡萄球菌编码的所有丙酮酸转运蛋白。

为了确定每个单独转运蛋白的功能，我们使用了由镉诱导型启动子驱动的互补载体，如图3C和D中用于lctP、lldP和lrgAB表达的载体。在需氧条件下，我们观察到带有空载体（pBK123）的Δ4突变体在补充丙酮酸（CDMP）或乳酸（CDML）的CDM中生长产量降低，类似于在CDM中观察到的生长产量，表明该菌株无法利用添加到培养基中的乳酸和丙酮酸。相反，在补充葡萄糖（CDMG）的CDM中，生长产量与野生型菌株没有差异，证实了lctP、lldP、lrgAB和B7H15_13955基因不影响葡萄糖代谢。有趣的是，过表达B7H15_13955和lrgAB导致Δ4突变体在补充乳酸和丙酮酸的CDM中的生长产量完全恢复，表明这两种转运蛋白可能是能够导入乳酸和丙酮酸的单羧酸转运蛋白。过表达lctP导致在丙酮酸和乳酸存在下的生长略有增强，但未达到B7H15_13955和lrgAB互补观察到的水平。最后，过表达lldP导致在丙酮酸或乳酸存在下的生长有轻微增强。24小时时的外源丙酮酸和乳酸测量值与观察到的生长表型相关，表明是（或缺乏）导入丙酮酸或乳酸的能力决定了在互补菌株中观察到的生长产量。总之，这些数据表明B7H15_13955是第四个能够导入丙酮酸的转运蛋白，因此，我们将该基因座命名为MonT，代表单羧酸转运蛋白。

Differential regulation of the pyruvate transporters

¹⁴C-丙酮酸转运实验显示Δ3突变体中丙酮酸导入显著减少，这使我们最初忽略了第四个转运蛋白MonT。我们假设¹⁴C-丙酮酸转运实验是在monT表达被抑制的条件下进行的。因为实验是在补充0.5 mM丙酮酸的TSBG中进行的，我们推测monT被碳分解代谢物抑制因子CcpA抑制。生物信息学分析揭示了monT上游存在一个潜在的分解代谢物响应元件位点。为了测试葡萄糖抑制monT表达，我们构建了一个由monT启动子驱动GFP表达的载体。我们在需氧条件下在TSB或补充0.5 mM丙酮酸的TSBG中监测GFP表达，后者是我们进行初始丙酮酸消耗实验和¹⁴C-丙酮酸转运实验的条件。我们观察到在TSBG + 0.5 mM丙酮酸中，P_monT::gfp载体的GFP表达极低，当从培养基中去除葡萄糖时，表达量有统计学意义的显著增加，表明当葡萄糖存在时monT被抑制。总之，这些数据表明丙酮酸转运蛋白的组成是差异调控的，并且可能存在特定条件，使得这些转运蛋白中的每一个都表达并作为丙酮酸和/或乳酸输入蛋白发挥作用。

DISCUSSION

丙酮酸是一种重要的代谢物，在需氧条件下为TCA循环提供能量，或在微氧/厌氧条件下或在过量葡萄糖存在下产生发酵副产物（乳酸、乙酸等）。尽管细菌具有多种导致丙酮酸产生的途径以驱动下游代谢途径，但它们也装备精良以从环境中吸收丙酮酸。事实上，已经使用毒性丙酮酸类似物3-FP在诸如大肠杆菌等生物中鉴定了几种丙酮酸转运蛋白，包括由btsT、cstA和yhjX基因编码的转运蛋白。在金黄色葡萄球菌中，我们的实验室证明了lrgAB操纵子在丙酮酸同化中的作用，这与在变形链球菌（Streptococcus mutans）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中lrgAB同源物的研究一致。然而，由于金黄色葡萄球菌lrgAB介导的丙酮酸同化仅限于微氧条件，并且生长在需氧条件下通过添加丙酮酸而增强，似乎很可能金黄色葡萄球菌编码额外的丙酮酸转运蛋白。因为生物信息学方法未能识别这些额外的丙酮酸转运蛋白基因，我们采用了一种非靶向的遗传方法，使用3-FP来产生丙酮酸转运突变体。产生的突变体的WGS揭示了三个基因lctP、lldP和monT的突变。

一些真核生物拥有单羧酸转运蛋白，参与在各种组织中进行L-乳酸、丙酮酸、短链脂肪酸和单羧酸药物的质子依赖性转运。此外，丙酮酸和乳酸转运蛋白可以是同向转运蛋白和反向转运蛋白，以相同或相反的方向移动这些代谢物。其他生物分离丙酮酸和乳酸的转运，并利用不同的转运蛋白来导入每种代谢物，例如大肠杆菌的乳酸转运蛋白lctP和lldP，以及丙酮酸转运蛋白btsT、cstA和yhjX。相比之下，Shewanella oneidensis的lctP2基因似乎在以丙酮酸或乳酸作为碳源生长时都是必需的，表明它能够介导任一种代谢物的转运。我们的¹⁴C-丙酮酸转运实验与过量冷丙酮酸和乳酸表明，在测试条件下，丙酮酸是主要的单羧酸被转运，因为冷乳酸没有减少¹⁴C-丙酮酸导入，而冷丙酮酸却减少了。相比之下，生长曲线显示Δ4突变体在补充乳酸或丙酮酸的CDM中生长减少，这可以通过过表达lrgAB完全互补，表明它可能是一种单羧酸转运蛋白。类似地，monT过表达完全恢复了在补充乳酸和丙酮酸的CDM中的生长产量至野生型水平，表明它也是一种单羧酸转运蛋白。尽管在富含葡萄糖的丰富培养基中¹⁴C-丙酮酸导入显著，但过表达lctP或lldP仅略微增强了在含有丙酮酸或乳酸的CDM中的生长。因为丙酮酸转运蛋白互补的表达受镉诱导型启动子的调控，我们推测尚未探索的其他条件也决定了优先导入哪种单羧酸分子。

在其他细菌物种中，lctP和lldP基因及其同源物似乎作为乳酸转运蛋白发挥作用。在枯草芽孢杆菌中，一个lldP同源物（与金黄色葡萄球菌lldP有51%同一性），命名为lutP，在以乳酸作为主要碳源生长时很重要，作为L-乳酸导入的主要转运蛋白。尽管破坏枯草芽孢杆菌lctP基因没有产生类似的表型，但假设lctP主要参与输出通过糖酵解产生的过量L-乳酸，而不是导入外部L-乳酸用作碳源。此外，作者提出lctP可能特别适应在低氧条件下发挥作用，其中乳酸脱氢酶倾向于有利于丙酮酸还原为乳酸，产生需要输出的过量乳酸。在金黄色葡萄球菌中，CidC可能执行类似的功能，除了将丙酮酸转化为最终被输出的乙酸。相比之下，破坏Azospirillum brasilense的lldP同源物（与金黄色葡萄球菌lldP有44%同一性）对该生物在以乳酸或丙酮酸作为唯一碳源生长时的能力有显著影响。因此，尽管这些基因之间存在序列相似性，但金黄色葡萄球菌的直系同源物似乎已经进化出对乳酸和丙酮酸的不同特异性。

有趣的是，大肠杆菌的双组分调控系统BtsSR（以前称为YehUT），它调控高亲和力转运蛋白BtsT，与金黄色葡萄球菌的LytSR双组分调控系统在结构上相似，后者调控lrgAB表达。BtsT蛋白（以前称为YjiY）是大肠杆菌中的一种次级转运蛋白，作为高亲和力丙酮酸/H⁺同向转运蛋白发挥作用。目前的研究表明它属于CstA样转运蛋白家族，并由btsT基因编码。BtsT转运蛋白在从指数生长期到稳定期的过渡期间变得至关重要，在此期间细胞经历营养耗尽。btsT的表达响应于细胞外丙酮酸而被诱导（类似于lrgAB），并且在碳限制条件下能够清除丙酮酸方面起着关键作用。典型的转运蛋白，BtsT包含多个跨膜结构域，并被认为利用跨膜质子梯度来驱动丙酮酸摄取。

丙酮酸转运是真核生物和细菌中的一个重要过程，在调节细胞代谢和能量生产中起着关键作用。尽管在细胞组织和复杂性上存在差异，但丙酮酸转运的调控在这两个生命领域之间似乎相似。在真核生物中，线粒体丙酮酸载体（MPC）复合物，由MPC1和MPC2蛋白组成，具有相似的生化特性。MPC1和MPC2蛋白是小的（12和15 kDa）、含跨膜结构域的蛋白质，它们在线粒体内膜内形成异源多聚体复合物。对这些蛋白质的体外和体内实验表明，MPC1和MPC2都是丙酮酸转运所必需的（类似于LrgAB所见）。此外，已经发现酵母的三种MPC蛋白根据它们是在呼吸还是发酵生长条件下形成不同的复合物，其中MPC1将与MPC2或MPC3形成复合物，取决于其环境条件。从进化上讲，这种分离可能是竞争选择压力之间权衡的结果，有利于在特定条件下发挥作用的特殊蛋白质的发展。我们实验室的研究表明，细菌中丙酮酸转运蛋白、氧水平和碳源之间可能存在类似的关系。例如，Endres等人确定了lrgAB编码的蛋白质在微氧条件下丙酮酸转运中的作用，表明存在其他在需氧生长期间有功能的丙酮酸转运蛋白。确实，如本研究所述，在需氧条件下起作用的额外丙酮酸转运蛋白的鉴定与这一假设一致。

总之，丙酮酸代谢是真核生物和原核生物中的一个重要过程，在调节细胞代谢和能量生产中起着重要作用，最终影响生物体的致病性。随着大量基因致力于丙酮酸摄取及其差异调控，很可能从独特生态位获取丙酮酸对于金黄色葡萄球菌的生存很重要。