靶向ESKAPE病原体TPP核糖开关的双荧光素酶报告基因分析及其在新型抗生素开发中的意义

本研究通过双荧光素酶报告基因系统（dual-luciferase reporter gene assay）深入分析了ESKAPE病原体中焦磷酸硫胺素（TPP）响应型核糖开关的功能特性，发现多数核糖开关对天然配体TPP有响应，但对合成类似物吡啶硫胺（pyrithiamine）不敏感。通过定点突变实验，鉴定出肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）中特定核苷酸位点（如P3茎区）与配体选择性相关。该研究为开发靶向核糖开关的新型抗菌药物提供了关键实验依据和结构基础。

　　

ABSTRACT

焦磷酸硫胺素（Thiamine pyrophosphate, TPP）响应型核糖开关是细菌中调控硫胺素（维生素B₁）生物合成和转运相关基因表达的遗传元件。胞内硫胺素被转化为TPP，作为糖酵解、三羧酸循环和磷酸戊糖途径等中心代谢途径中酶的辅因子。TPP核糖开关是细菌中最广泛的核糖开关类型，因其在代谢中的关键作用且不存在于人类中，成为潜在的抗生素靶点。本研究聚焦于ESKAPE病原体组：粪肠球菌（Enterococcus faecium）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和肠杆菌属（Enterobacter spp.）。

为开发靶向TPP核糖开关的新型抗菌剂，本研究首先鉴定了这些细菌中多种TPP核糖开关的功能特性。研究人员开发了一种双荧光素酶报告基因 assay，用于监测核糖开关活性。结果表明，大多数预测的TPP核糖开关确实具有功能调节作用，并能响应TPP。与大肠杆菌（Escherichia coli）的thiC TPP核糖开关不同，来自ESKAPE细菌的TPP核糖开关对合成硫胺素类似物吡啶硫胺（pyrithiamine）无响应。以肺炎克雷伯菌的一个TPP核糖开关（Kp04）为例，通过定点突变实验鉴定出特定核苷酸（位于P3茎区）负责其对吡啶硫胺的不响应性，这一发现为开发新型TPP核糖开关靶向抗菌剂提供了依据。

IMPORTANCE

核糖开关是控制细菌重要过程的RNA分子。ESKAPE病原体感染常见，且亟需新的对抗策略。小分子化合物可被设计用于结合核糖开关并阻断其活性。本研究分析了ESKAPE病原体的TPP核糖开关对小分子结合的响应，开发了双荧光素酶报告基因 assay。大多数预测的TPP核糖开关是功能性调节器，因此可作为新型抗感染药物的靶点。吡啶硫胺不能阻断所有测试的TPP核糖开关，并发现了这一行为的结构基础。

INTRODUCTION

代谢物感应型细菌核糖开关通常位于mRNA的5′非翻译区，控制代谢相关蛋白的合成。核糖开关由适体域（aptamer domain）和下游表达平台（expression platform）组成。适体负责结合特定小分子配体，而表达平台将配体诱导的构象变化转化为转录或翻译机器的响应。目前已发现55类不同的核糖开关，可选择性感应小分子或离子，其中最大的一类包括结合并响应酶辅因子FMN（黄素单核苷酸）、腺苷钴胺素或TPP的核糖开关。TPP核糖开关控制硫胺素生物合成和摄取相关基因的表达，是分布最广的核糖开关。

TPP核糖开关调控大肠杆菌thiC（编码磷酸甲基嘧啶合酶，EC 4.1.99.17）和thiM（编码羟乙基噻唑激酶，EC 2.7.1.50）的表达，是首批经实验验证的TPP核糖开关。它们已被深入研究，包括结构分析和配体识别研究。肠杆菌科中thiBPQ基因编码硫胺素和TPP的ABC转运蛋白，其表达也受核糖开关调控。已知TPP核糖开关适体的结构高度保守，RNA形成两个结合口袋：一个由P2和P3茎组成，包围TPP的嘧啶部分；另一个协调TPP的带负电焦磷酸基团，通过Mg²⁺离子与P4和P5茎的核苷酸形成直接和间接（水介导）键合。TPP的中央噻唑环在配体识别中作用较小，因其被其他带正电的杂环取代后对结合亲和力影响不大。

MATERIALS AND METHODS

细菌培养：大肠杆菌DH5α（硫胺素营养缺陷型）和MG1655（硫胺素原养型）在M9最小培养基中培养，补充0.1% casamino acids和0.4%葡萄糖。肺炎克雷伯菌培养于24孔板中，条件类似。

质粒和菌株构建：所有寡核苷酸用于质粒构建和测序。双荧光素酶质粒以pPrib-RibDG-RFN-luc为骨架，基于高拷贝数（colE1复制起点）单荧光素酶报告质粒pT7luc。萤火虫荧光素酶lucF作为报告基因，密码子适配的海肾荧光素酶lucR被引入作为第二个报告基因，用于归一化。通过PCR和限制酶切连接构建各种核糖开关报告质粒，并通过定点突变进行修饰。

双荧光素酶 assay：过夜培养物接种至测试培养基，添加10 μM硫胺素或吡啶硫胺，培养4小时后收获细胞。用被动裂解缓冲液（PLB）裂解细胞，测定总蛋白含量。稀释样品后，使用Tecan Spark读板器测量荧光素酶活性（LucF和LucR）。

β-半乳糖苷酶 assay：用于测试吡啶硫胺以外的硫胺素类似物。培养物在96孔板中生长，添加化合物后测定LacZ活性。

吡啶硫胺抗性肺炎克雷伯菌筛选：通过逐步增加吡啶硫胺浓度筛选抗性菌株，直至生长速率与野生型相当。纯培养后通过PCR和测序分析TPP核糖开关。

TPP水平测定：通过HPLC分析细胞提取物中的TPP含量。

生物信息和统计分析：使用PASIFIC和ViennaRNA预测核糖开关二级结构，AlphaFold 3预测三级结构。统计使用Excel或GraphPad Prism，进行双尾Student t检验。

RESULTS

使用双荧光素酶系统表征ESKAPE病原体的TPP响应核糖开关

研究发现，大多数预测的TPP核糖开关在体内测试系统中响应TPP。例如，肠杆菌属的thiC（Eb01）和thiBPQ（Eb03）、铜绿假单胞菌thiC（Pa01）和动物病原体Mammaliicoccus sciuri的thiC（Ms02）核糖开关在添加硫胺素后显著降低荧光素酶活性。Eb03主要在翻译水平调控，而其他核糖开关显示转录或双重调控。鲍曼不动杆菌（Ab01）、肺炎克雷伯菌（Kp04）和M. sciuri的tenA（Ms01）核糖开关在结合自身启动子时对硫胺素有响应，但E. faecium的thiT（Ef02）响应较弱。金黄色葡萄球菌的thiBPQ核糖开关（Sa02）未能成功测试。

ESKAPE细菌的TPP核糖开关对吡啶硫胺无响应

吡啶硫胺对大肠杆菌thiC核糖开关（Ec01）有负调控作用，但对ESKAPE病原体的核糖开关无此效应。有趣的是，肺炎克雷伯菌Kp04核糖开关在吡啶硫胺存在下报告基因活性增加，表明配体结合可能促进了核糖体结合位点的暴露。通过HPLC证实硫胺素和吡啶硫胺均被大肠杆菌摄取并代谢。

比较大肠杆菌和肺炎克雷伯菌TPP核糖开关的一级和三级结构显示微小差异

Kp04和Ec01的适体区高度相似，但Kp04在P3茎区有两个“插入”（核苷酸21–37和42–48），并且在位置63有一个腺苷（A）而非尿苷（U）。预测的三级结构显示这些插入延伸了P3茎，可能影响配体识别。

肺炎克雷伯菌thiC核糖开关P3区的单核苷酸缺失产生吡啶硫胺响应型变体

构建Kp04变体（A63U、Δ21–37、Δ42–48）并测试其对硫胺素和吡啶硫胺的响应。发现Δ42–48变体对吡啶硫胺有响应，而其他变体无此效应。进一步的单核苷酸缺失实验表明，缺失42G、43U或46A可使Kp04响应吡啶硫胺，其中Δ46A响应最强。将Kp04的扩展P3茎序列插入Ec01并未改变其对吡啶硫胺的响应，表明其他核苷酸也参与配体选择性。

肺炎克雷伯菌含有四个TPP核糖开关，对吡啶硫胺响应不同

Kp01（thiBPQ）、Kp10（tenA）和Kp11（thiMD）均为功能性TPP核糖开关。Kp01和Kp11对吡啶硫胺有响应（但弱于硫胺素），而Kp10无响应。序列比较未揭示响应差异的具体核苷酸。通过筛选吡啶硫胺抗性菌株，未发现核糖开关或启动子突变，表明核糖开关可能不是吡啶硫胺的主要靶点。

DISCUSSION

核糖开关作为RNA分子，在细菌生物学过程中起关键作用，是创新药物设计的潜在靶点。TPP核糖开关因其广泛分布和保守性，被视为有希望的抗生素靶点。本研究通过双荧光素酶报告系统证实了ESKAPE病原体中多个TPP核糖开关的功能，并揭示了它们对吡啶硫胺的普遍不敏感性。

研究发现，单核苷酸变化（如P3茎区的缺失）可改变核糖开关对配体的选择性，而不影响其天然配体响应。这一发现强调了核糖开关结构的可塑性及其在药物设计中的潜力。扩展的P3茎可能在配体识别中起间接作用，尽管其不直接参与结合，可能通过稳定适体结构或影响动力学特性来调节配体选择性。

尽管吡啶硫胺对多数ESKAPE核糖开关无效，但筛选或合理设计针对特定核糖开关结构的小分子仍有望开发出新型抗菌剂。类似策略已在FMN核糖开关中成功应用（如ribocil和玫瑰黄素）。未来的研究应聚焦于针对ESKAPE病原体特异核糖开关结构的高通量筛选和基于结构的药物设计。

ACKNOWLEDGMENTS

本研究由德国联邦教育与研究部（BMBF）资助（项目号FKZ 01KI1826）。