革兰阴性菌血流感染快速药敏检测新突破：VITEK REVEAL、VITEK 2-RAST与DD-RAST头对头比较研究

本研究首次在大规模前瞻性革兰阳性血培养（GN-PBCs）样本中，对三种快速抗菌药物敏感性测试（RAST）系统——VITEK REVEAL、VITEK 2-RAST和EUCAST磁盘扩散法（DD-RAST）进行了直接比较。结果显示，VITEK REVEAL在保证高准确度（分类一致性≥98.3%）的同时，显著缩短检测时间（平均6小时32分钟），尤其适用于耐药菌和β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂（BL/BLI）抗生素的快速检测，为临床血流感染（BSI）的及时管理和抗菌药物精准使用提供关键支持。

　　

ABSTRACT

革兰阴性（GN）血流感染中早期抗菌药物敏感性测试（AST）对指导合理治疗至关重要。本研究评估了三种快速AST（RAST）系统——VITEK REVEAL、直接血培养VITEK 2（VITEK 2-RAST）和EUCAST磁盘扩散法（DD-RAST），使用220例前瞻性收集的GN阳性血培养（GN-PBCs）。共测试18种GN菌，包括肠杆菌目（Enterobacterales）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），针对25种抗生素，其中4种为新一代β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂（BL/BLI）抗生素。使用参考肉汤微量稀释法（BMD）进行比较。VITEK REVEAL检测显示，在3,603个菌株/抗生素组合中，基本一致性（EA）为97.1%，偏差为-7.7，分类一致性（CA）为98.3%。VITEK 2-RAST检测在3,941个组合中EA为96.2%，偏差为-10.4，CA为98.4%。DD-RAST检测在2,388个组合中CA为98.2%。在164个使用所有三种检测的GN-PBCs中，VITEK REVEAL和VITEK 2-RAST的EA率分别为97.5%和96.3%，偏差值分别为-7.1和-6.9。所有三种检测的CA率均≥98.2%，极重大错误（VME）率≤1.8%。VITEK REVEAL的平均结果时间（TTR）显著短于VITEK 2-RAST（13小时51分钟）和DD-RAST的固定8小时。在耐药菌中，VITEK REVEAL的结果比敏感或中介菌更快，包括BL/BLI抗生素。鲍曼不动杆菌的TTR最短，且未观察到VME。这些结果支持在GN-PBCs上直接使用RAST，VITEK REVEAL成为快速准确检测的一个特别有前景的选择。

IMPORTANCE

本研究首次在大规模前瞻性收集的GN阳性血培养（GN-PBCs）中直接比较三种快速抗菌药物敏感性测试（RAST）系统——VITEK REVEAL、VITEK 2-RAST和DD-RAST。数据为实验室评估RAST实施提供了宝贵见解，特别是在基于EUCAST的环境中。在测试的系统中，VITEK REVEAL以其快速周转和高准确度的结合脱颖而出，包括针对抗生素耐药菌和β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂（BL/BLI）抗生素。这些发现强调了RAST系统直接从GN-PBCs提供及时可靠药敏结果的潜力，从而支持更有效的抗菌药物管理和临床决策。然而，实际影响还取决于这些系统与常规工作流程的整合程度，因为无缝实施可以直接影响结果时间（TTR）——这是优化GN血流感染（BSI）管理的关键要素。

INTRODUCTION

革兰阴性（GN）细菌引起的血流感染（BSIs）（GN-BSIs）具有高发病率和死亡率风险，特别是在未及时给予有效抗菌治疗时。在脓毒症休克患者中，每延迟一小时接受适当抗菌药物与死亡率 measurable 增加相关。即使在病情较轻的患者中，延迟开始有效治疗也与住院时间延长和更差的临床结果相关。因此，直接从阳性血培养（PBCs）进行的表型快速抗菌药物敏感性测试（RAST）对于指导及时适当治疗、减少不必要的广谱抗菌药物使用和支持抗菌药物管理 efforts 至关重要。

几种商业系统最近引入以允许RAST报告（通常在血培养阳性后8小时或更短时间内），依赖于加速表型抗菌药物敏感性测试（AST） beyond 传统基于传代的AST检测速度的技术，然后直接从PBCs实现更快结果。2024年MacVane和Dwivedi综述的系统包括ASTar（Q-linea）、LifeScale（Affinity Biosensors）、下一代表型检测（Selux）、PhenoTest BC（Accelerate Diagnostics）和VITEK REVEAL（bioMérieux），这些均获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准。VITEK REVEAL系统代表了一种基于检测细菌代谢过程中释放的挥发性有机化合物（VOCs）的新方法。它使用96孔肉汤微量稀释（BMD）板在大约5.5–6小时内生成最低抑菌浓度（MIC）值。最近在GN菌血症中的评估显示与常规AST检测（Sensititre、VITEK 2或MicroScan WalkAway） excellent 一致性。使用VOC sensing 使系统能够提供快速结果，同时保持与参考BMD检测的概念相似性，后者仍然是MIC测定的金标准。

GN-PBCs的RAST也可以直接使用VITEK 2系统（即绕过传代）或EUCAST直接接种磁盘扩散板进行，后者提供可在4、6和8小时解读的抑菌圈直径。这些方法已经嵌入许多临床BSI工作流程，如在我们实验室，并可能被视为 practical、低成本解决方案，值得 further 大规模评估。

GN病原体中抗菌药物耐药性日益流行 further 复杂化经验性治疗选择和临床管理。值得注意的是，获得AST结果所需的时间可能根据病原体的耐药谱而变化。在Ostermann等人最近使用VITEK REVEAL的研究中，观察到结果时间（TTR）与耐药 prevalence 之间存在显著负相关（耐药率每增加1%，TTR减少0.018小时；P < 0.0001），表明耐药菌在某些RAST系统中可能 yield 更快结果。相比之下，MacVane等人报告，在难治耐药表型和碳青霉烯类不敏感菌株的患者中，新一代抗菌药物的TTR延长1天。这种延迟归因于涉及反射测试的传统工作流程——其中新一代药物仅在检测到对一线药物耐药时进行测试，而不是包含在 primary AST panels/卡片中。虽然资源高效，但这种级联测试可能无意中延迟新抗菌药物的最终结果，强调了能够提供广谱、快速药敏数据而不依赖逐步测试策略的RAST系统/检测的价值。

在本研究中，我们对三种RAST检测——VITEK REVEAL、直接血培养VITEK 2（VITEK 2-RAST）和EUCAST快速磁盘扩散（DD-RAST）——在GN-PBCs上进行了比较评估。每种检测的结果与在传代 derived 分离株上进行的EUCAST参考BMD进行了比较。重点放在TTR上，特别是针对新一代β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂（BL/BLI）抗生素和抗菌药物耐药菌。在 selected 显示VITEK REVEAL和参考BMD检测之间不一致结果的 cases 中，进行了群体分析谱（PAP）实验以调查潜在异质性耐药。

MATERIALS AND METHODS

Study setting, clinical samples, and antimicrobial agents

本研究在意大利罗马的Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS的临床微生物学实验室进行。研究方案概述于图1。在研究期间（2024年1月至2024年6月）处理的17,525例临床血培养中，3,083例（17.6%）细菌生长阳性，其中922例（29.9%） yield GN菌。仅包括来自独特患者的GN-PBCs。

PBC样本来自血培养（BC）瓶（BacT/Alert FA Plus [需氧]和FN Plus [厌氧]，bioMérieux），在BacT/Alert Virtuo自动化BC系统（bioMérieux）中孵育后阳性。对于每个阳性BC，选择第一个 flagged 阳性并可进行微生物学测试的需氧或厌氧瓶。样本在周一至周五上午8:00至下午6:00之间处理，确保所有RAST检测在标准化条件下及时执行和读取。此时间表还允许在细菌过度生长（即<10⁹ CFU/mL）之前进行测试，这对DD-RAST尤为重要， given 其短孵育时间和使用非标准化接种物。此外，它确保VITEK REVEAL测试在制造商推荐的16小时窗口内 well 进行。

所有 eligible PBC样本进行革兰染色，仅包括单微生物GN-PBCs。物种水平鉴定使用直接基质辅助激光解吸电离-飞行时间（MALDI-TOF）质谱 based 检测（Bruker Daltonics）进行。每个瓶的等分试样用于直接RAST检测和 parallel 在MacConkey和5%绵羊血胰蛋白酶大豆琼脂（bioMérieux）上传代。如果MALDI-TOF鉴定失败或琼脂上观察到混合生长，则排除样本。 overnight 传代获得的菌落然后用于参考BMD AST检测和通过MALDI-TOF质谱确认物种鉴定。

每种检测中测试的抗菌药物及其浓度的详细信息，以及三种RAST检测和EUCAST参考BMD检测（其中测试了所有组合）中测试的细菌物种/抗菌药物组合在补充材料（表S1和S2）中提供。总共测试了18种GN细菌物种，包括13种肠杆菌目和5种非肠杆菌目。七个物种最具代表性（≥8个菌株）：大肠杆菌（Escherichia coli）（n = 74）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）（n = 54）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）（n = 22）、奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）（n = 16）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）（n = 14）、产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）（n = 9）和粘质沙雷菌（Serratia marcescens）（n = 8）。

VITEK REVEAL assay

使用VITEK REVEAL系统的RAST检测使用25 μL每个GN-PBC样本，直接1:1,000稀释在Pluronic水（Beckman Coulter）中，无需事先去除血细胞。然后，115 μL稀释样本接种到VITEK REVEAL GN01-AST板孔中，该板包含针对GN菌的抗生素 panel。每个AST板覆盖有专有传感器 panel，由七个比色化学传感器阵列组成，位于每个孔上方，并使用专用板密封器（Beckman Coulter）密封。板条码标记并加载到VITEK REVEAL仪器中，在37°C连续 agitation 下孵育，每10分钟成像一次。传感器阵列中的比色变化，由细菌代谢过程中释放的VOCs诱导，允许系统实时确定MIC值。每个板上一个孔作为生长对照（生长培养基，无抗生素），另一个作为阴性对照（无生长培养基）。 previously 获得的细菌鉴定输入系统界面以启用MIC解读。检测协议遵循我们验证研究中 detailed 的程序，并与其他组报告的程序一致， according 制造商 instructions。

VITEK 2-RAST assay

使用VITEK 2系统的RAST检测使用AST-N438、AST-XN26和AST-N440卡片进行，前两个适用于肠杆菌目，第三个适用于非发酵物种（如铜绿假单胞菌）。这些卡片包含预定义系列抗菌药物在各种浓度下，并通过细菌生长的 turbidimetric 监测 enable MIC测定。协议 adapted from previously 发布程序， with 轻微修改以允许直接测试GN-PBC样本。简要地，固定体积（5 mL）每个GN-PBC样本转移到BD Vacutainer血清分离管（BD）中，以3,500 × g离心15分钟。 resulting 细菌沉淀重悬于无菌盐水（bioMérieux）中，调整至0.5 McFarland浊度，在VITEK 2比色杯中测量。此悬浮液然后用于接种适当的AST卡片，在VITEK 2仪器中孵育。MIC值和 interpretive 类别使用高级专家系统（v9.02；bioMérieux）自动分配。

DD-RAST assay

DD-RAST检测根据EUCAST为直接从PBCs进行直接AST开发的方法进行。此方法已 specifically 验证用于四种GN细菌物种——大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌——并 intended 用于孵育12小时内 flagged 阳性的需氧BC瓶。根据EUCAST推荐，细菌悬浮液为DD-RAST直接从阳性瓶肉汤制备，无需离心或传代，并 promptly（阳性后15分钟内）铺板。检测使用Mueller-Hinton琼脂（bioMérieux）和商业抗生素磁盘，具有预定义抑菌圈直径 breakpoints 用于不同孵育时间。在本研究中，抑菌圈在35°C ± 1°C环境空气中孵育8小时后读取，并使用EUCAST快速AST breakpoints 用于8小时时间点解读敏感性类别。

Reference BMD assay

所有细菌分离株的参考MIC值使用EUCAST BMD方法确定，并包括研究中测试的所有25种抗菌药物， comprising 6种BL/BLIs和19种非BL/BLI agents。其中，四种药物——氨苄西林/舒巴坦、头孢曲松、依拉环素和亚胺培南/瑞莱巴坦——被排除在VITEK REVEAL检测外；哌拉西林被排除在VITEK 2-RAST检测外；七种药物——氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢曲松、依拉环素、厄他培南、哌拉西林和替加环素——被排除在DD-RAST检测外。

BMD程序如 previously 描述进行，遵循ISO 20776-1:2019指南，使用阳离子调节Mueller-Hinton（caMH）肉汤（Thermo Fisher Scientific），并使用为每批测试新鲜、手动制备的BMD板。简要地，每个细菌分离株的三到五个菌落悬浮在无菌盐水（bioMérieux）中以制备0.5 McFarland标准。 resulting 悬浮液然后在caMH肉汤中稀释以实现 approximately 5 × 10⁵ CFU/mL的细菌接种物。50 μL此悬浮液分配到包含所选抗菌药物的预制备BMD板的每个孔中，每个分离株使用一个板。板在35°C 5% CO₂ atmosphere 中孵育，并 visually 读取以确定所有测试药物的MIC值。

Population analysis profile assay

PAP检测用于通过将细菌悬浮液的系列稀释铺板到含有 increasing 浓度的测试抗菌药物的Mueller-Hinton琼脂（MHA）板上来调查异质性耐药亚群的存在。对于每个分离株，制备10倍稀释系列（从10⁸到10² CFU/mL）在磷酸盐缓冲盐水中。每个稀释度的等分试样（100 μL） duplicate 铺板到补充有0、1、2、4、8和16 μg/mL抗菌药物的MHA板上。为减少检测 pre-existing 耐药突变体的可能性并最小化接种物依赖性效应，使用低起始细胞密度并在必要时进一步稀释。在35°C孵育24小时后，在每个抗生素浓度进行菌落计数，细菌生长表示为log₁₀ CFU/mL。然后通过绘制菌落计数对抗菌药物浓度生成PAP曲线，允许 graphical 识别异质性耐药模式。

Data analysis

MIC值——或在DD-RAST case 中，抑菌圈直径值——根据2024 EUCAST临床 breakpoints（v14.0）或，如适用，RAST-specific breakpoints（v7.0）解读。根据ISO 20776-2:2021指南，MIC定义为指定孵育期后 visibly 抑制细菌生长的抗菌药物最低浓度。BMD检测作为参考方法评估三种RAST检测的性能：VITEK REVEAL、VITEK 2-RAST和DD-RAST。

基本一致性（EA）仅针对VITEK REVEAL和VITEK 2-RAST评估，并定义为MIC结果在参考BMD MIC的±1个 twofold 稀释内的百分比。超出范围的MIC值调整到测试范围内最近的可报告浓度以允许包含在EA计算中。EA率≥90%被视为可接受。

偏差为VITEK REVEAL和VITEK 2-RAST计算， according ISO 20776-2:2021。对于每个具有至少25个在范围MIC值的抗菌药物，分离株根据其BMD MICs分组。测试MIC高于和低于参考MIC的百分比 determined，这些百分比之间的差异用于估计偏差。可接受偏差定义为从-30%到+30%范围。

分类一致性（CA）为所有三种RAST检测计算，并定义为测试检测和BMD检测 yield 相同 categorical 解读——敏感（S）；敏感，增加暴露（I； formerly 中介），或耐药（R）的分离株百分比。分类错误 classified 为极重大错误（VME；假敏感）、重大错误（ME；假耐药）和轻微错误（mE；S和I或I和R之间的 discrepancies），根据ISO 20776-2:2007标准。CA率≥90%和VME率<3%被视为可接受。

TTR以小时记录，并为每个细菌物种/抗菌药物组合通过求和获得最终结果所需的动手时间和孵育时间计算。对于每种检测，计算平均TTR ± 标准偏差（SD）并按敏感性类别（S、I或R）分层。组间（如S vs R）统计比较使用单向方差分析或Student t-test进行。数据分析和可视化使用R软件（v2023.09.1）和GraphPad Prism（v10）进行。

RESULTS

Overview of samples and assay scope

总共220例临床GN-PBC样本 included 在研究中，每个 yield 单一菌株。所有样本使用VITEK 2-RAST检测测试，而子集也使用VITEK REVEAL检测（n = 200）和DD-RAST检测（n = 164）测试。每种检测的样本选择取决于细菌物种/抗菌药物兼容性。在25种测试的抗生素中，7种为BL/BLI抗生素，包括4种新一代抗菌药物：头孢他啶/阿维巴坦、头孢洛扎/他唑巴坦、亚胺培南/瑞莱巴坦和美罗培南/瓦博巴坦。220个菌株中，179个为肠杆菌目，22个为鲍曼不动杆菌，14个为铜绿假单胞菌。额外物种，仅使用VITEK 2-RAST检测测试，包括嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）（n = 3）、豚鼠气单胞菌（Aeromonas caviae）（n = 1）和鲁氏不动杆菌（Acinetobacter lwoffii）（n = 1），总共18个物种。如详述在表S2中，并非所有菌株/抗生素组合使用所有三种检测测试。然而，对于每种检测评估的四种物种（大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌），比较测试使用多达15种抗生素进行。其中，阿米卡星、环丙沙星、亚胺培南、美罗培南和妥布霉素包含在所有三种检测中。

VITEK REVEAL vs reference BMD comparison

从使用VITEK REVEAL检测测试200个菌株获得的3,614个结果中，3,603个可评估性能评估：3,205个用于164个肠杆菌目，286个用于22个铜绿假单胞菌，112个用于14个鲍曼不动杆菌。11个结果被排除，因为10例中MIC值落在技术不确定性区（ATU）内，或剩余1例中缺失MIC值。总体EA率为97.1%（3,499/3,603），总体偏差为-7.7（307个在范围结果），总体CA率为98.3%（3,542/3,603）。当按菌株组分层时，肠杆菌目的EA率为97.1%（3,113/3,205），铜绿假单胞菌为95.8%（274/286），鲍曼不动杆菌为100%（112/112）。偏差值肠杆菌目为-6.9（232个在范围结果），铜绿假单胞菌为-22.5（73个在范围结果）；偏差不适用于鲍曼不动杆菌。最低EA率（<90%）观察到肠杆菌目/头孢他啶（87.1%，142/163结果；偏差：-25.0，49个在范围结果）、铜绿假单胞菌/头孢吡肟（81.8%，18/22结果）和铜绿假单胞菌/头孢他啶（86.4%，19/22结果）。CA率肠杆菌目为98.3%（3,150/3,205），铜绿假单胞菌为97.9%（280/286），鲍曼不动杆菌为100%（112/112）。

在显示与VITEK REVEAL检测分类错误的肠杆菌目和铜绿假单胞菌分离株中，相应的菌株/抗生素组合包括与参考BMD MIC值在EA或不在EA的MIC值。图2a和b说明了各种菌株/抗生素组合的MIC偏差分布和方向，强调了非EA结果的比例和幅度及其对观察到的偏差的贡献。大多数非EA结果聚集在粉红色圆形区域，其中包括高于相应BMD值的MIC值，偏差范围从+1到+8 log₂稀释。这些偏差的总体向上偏移表明对某些抗生素或菌株的系统性MIC高估。

VITEK 2-RAST vs reference BMD comparison

从使用VITEK 2-RAST检测测试220个菌株获得的3,960个结果中，3,941个可评估性能评估：3,595个用于179个肠杆菌目，264个用于22个铜绿假单胞菌，70个用于14个鲍曼不动杆菌，12个用于5个其他物种。19个结果被排除，因为MIC值落在ATU内。总体EA率为96.2%（3,793/3,941），总体偏差为-10.4（758个在范围结果），总体CA率为98.4%（3,876/3,941）。当按菌株组分层时，肠杆菌目的EA率为96.4%（3,466/3,595），铜绿假单胞菌为92.8%（245/264），鲍曼不动杆菌为100%（70/70），其他物种为100%（12/12）。偏差值肠杆菌目为-12.7（548个在范围结果），铜绿假单胞菌为+5.8（208个在范围结果）；偏差不适用于鲍曼不动杆菌或其他物种。最低EA率（<90%）观察到肠杆菌目/头孢吡肟（87.8%，144/164结果；偏差：-27.1，32个在范围结果）、肠杆菌目/头孢他啶（88.3%，158/179结果；偏差：-36.2，53个在范围结果）、铜绿假单胞菌/头孢吡肟（72.7%，16/22结果）和铜绿假单胞菌/哌拉西林/他唑巴坦（77.3%，17/22结果）。CA率肠杆菌目为98.4%（3,537/3,595），铜绿假单胞菌为97.3%（257/264），鲍曼不动杆菌为100%（70/70），其他物种为100%（12/12）。

在显示与VITEK 2-RAST检测分类错误的肠杆菌目和铜绿假单胞菌分离株中，相应的菌株/抗生素组合包括与参考BMD MIC值在EA或不在EA的MIC值。图2（面板c和d）说明了各种菌株/抗生素组合的MIC偏差分布和方向，强调了非EA结果的比例和幅度及其对观察到的偏差的贡献。大多数非EA结果聚集在粉红色圆形区域，其中包括高于相应BMD值的MIC值（偏差从+1到+8 log₂稀释），或绿色圆形区域，其中包括低于相应BMD值的MIC值（偏差从-1到-8 log₂稀释）。这些相反偏移表明对某些抗生素或菌株的系统性MIC高估或低估。

DD-RAST vs reference BMD assay comparison

从使用DD-RAST检测测试164个菌株获得的2,520个结果中，2,388个可评估性能评估：2,003个用于128个肠杆菌目（74个大肠杆菌和54个肺炎克雷伯菌），276个用于22个铜绿假单胞菌，109个用于14个鲍曼不动杆菌。132个结果被排除，因为127例中MIC值落在ATU内，或剩余5例中落在类别I内。总体CA率为98.2%（2,345/2,388）；当按菌株组分层时，CA率分别为98.1%（1,965/2,003）、98.6%（272/276）和99.1%（108/109）。

Head-to-head comparison of the three study assays

通过测试164个GN菌株使用所有三种检测，生成2,978、3,096和2,520个菌株/抗生素组合，分别使用VITEK REVEAL、VITEK 2-RAST和DD-RAST检测，其中2,969、3,078和2,388个可评估比较性能评估。虽然表1–3报告个体检测性能指标（EA和CA），但表4设计用于 facilitate 三种检测的直接、并排比较。此比较仅适用于肠杆菌目中的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌。总体EA率VITEK REVEAL为97.5%（2,896/2,969），VITEK 2-RAST为96.3%（2,967/3,078）；偏差值分别为-7.1（249个在范围结果）和-6.9（624个在范围结果）。总体CA率VITEK REVEAL为98.4%（2,921/2,969），VITEK 2-RAST为98.4%（3,029/3,078），DD-RAST为98.2%（2,345/2,388）。

Analysis of discordant results

观察到的三种检测的分类错误总结在表5中。在18个测试的GN细菌物种中，九个 exhibited 至少一个分类错误。最常与ME、VME和mE相关的抗生素是哌拉西林/他唑巴坦（n = 15）、