基于RNA感知与ADAR编辑的乙型肝炎病毒报告系统开发及其应用研究

本综述介绍了一种创新的HBV-RADARS报告系统，该系统通过感知HBV RNA并依赖ADAR1介导的A-to-I RNA编辑激活报告基因表达，克服了传统重组HBV报告病毒复制能力受损的局限。该系统兼容多种报告蛋白（如荧光素酶、抗生素抗性基因），可在转染、整合转录本表达及真实HBV感染等多种细胞模型中定量反映HBV RNA水平，为高通量筛选抗HBV化合物及宿主因子提供了全新平台。

　　

乙型肝炎病毒（HBV）感染的持久性主要归因于病毒共价闭合环状DNA（cccDNA）在感染肝细胞核内的长期存在。尽管现有核苷（酸）类似物能有效抑制病毒复制，但功能性治愈仍难以实现。传统HBV报告病毒因基因组紧凑性（3.2 kb）和重叠开放阅读框的限制，插入报告基因常导致病毒复制能力下降，且仅支持单轮感染。为突破此技术瓶颈，本研究基于可重编程腺苷脱氨酶作用于RNA传感器（RADARS）技术，开发了不干扰病毒生命周期的HBV RNA感知报告系统。

靶点选择与传感器优化

研究团队首先在HBV基因型D RNA中系统扫描了66个ADAR可编辑位点（5′-CCA-3′对应传感器中的5′-TAG-3′），通过共转染HBV RNA表达质粒（pHBV1.3）与含高斯荧光素酶（Gluc）报告基因的RADARS构建体，评估各靶点的编辑效率。结果显示，最优靶点位于HBx开放阅读框内的1570–1716区域（C1643位点）。进一步通过6 nt间隔的传感器长度梯度测试（51–171 nt），发现141 nt传感器（互补于HBV RNA 1573–1713区域）可产生最高且最稳定的Gluc激活倍数（22.4倍），因此被选为原型HBV-RADARS。

机制验证与特异性分析

通过构建传感器序列反向的HBV-RADARS-Rev及组成型表达对照HBV-RADARS-On，证实报告系统激活严格依赖传感器与靶RNA的特异性杂交。RT-qPCR及高通量测序显示，靶RNA存在时传感器区域A-to-I编辑率提升30倍。跨基因型测试发现，尽管不同基因型（A、B、C）的HBsAg表达量更高，但原型传感器（基于基因型D）仍因序列完全匹配而呈现最强激活，凸显序列互补性对ADAR编辑效率的关键影响。

ADAR1依赖性验证

在内源性ADAR1 p110亚型表达的HepG2-NTCP-C4细胞中，ADAR1 siRNA敲低可剂量依赖性降低报告系统激活，而过表达野生型ADAR1（非编辑活性突变体E912A）则显著增强Gluc信号。值得注意的是，ADAR1过表达虽提升灵敏度，但会导致靶RNA非依赖性背景信号增强，提示内源性ADAR水平已足够支撑系统功能。

RNA水平定量关联与免疫应答评估

梯度稀释靶RNA表达质粒（pCMV-HBV2.1）的实验表明，Gluc激活水平与HBV RNA含量呈正相关。在稳定表达HBV转录本的HepG2.2.15细胞中，RNA去稳定剂RG7834处理可同步降低HBV RNA及报告信号。尽管RADARS机制涉及双链RNA形成，但转染或感染条件下均未检测到显著IFN-β诱导，可能与ADAR编辑本身抑制天然免疫应答及肝癌细胞dsRNA感应缺陷有关。

真实感染模型应用

在HBV感染（5,000 GE/细胞）的HepG2-NTCP-C4细胞中，报告系统显示16倍Gluc激活，且可被进入抑制剂MyrB完全阻断或RG7834部分抑制。感染组传感器编辑率提升约2倍（0.18%至0.36%）。将报告基因替换为GFP或嘌呤霉素抗性基因（Puro^r）后，系统成功实现感染细胞可视化及药物筛选：感染后施加嘌呤霉素可有效富集HBc阳性细胞（存活率5%–10%），为遗传筛选提供可能。

技术优势与优化方向

相较于传统重组病毒报告系统，HBV-RADARS具有三大优势：不干扰病毒复制周期、支持多类型报告蛋白灵活设计、构建流程简便。当前系统在感染模型中灵敏度仍受限于cccDNA低拷贝数及核内转录空间隔离，未来可通过优化传感器二级结构预测、引入多重终止密码子调控翻译阈值进一步提升信噪比。

综上，HBV-RADARS作为一种活细胞报告平台，为剖析HBV-宿主互作机制、筛选新型治疗靶点提供了强大工具，有望推动慢性乙型肝炎功能性治愈策略的开发。