乙型肝炎病毒基因组与活性染色质中心关联挑战宿主复制保真度导致DNA损伤

本研究揭示乙型肝炎病毒（HBV）通过其共价闭合环状DNA（cccDNA）与宿主细胞活性染色质中心（特别是富含DDIT3结合元件的转录活性启动子区域）的关联，早期诱发复制应激（replication stress），进而引发全局性DNA损伤反应（DDR），为理解HBV相关肝细胞癌的发病机制提供了新视角。

　　

乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球肝细胞癌（HCC）的主要致病因素，近3亿人受其影响。尽管现有抗病毒疗法能控制慢性感染，但极少能临床治愈HBV，其核心障碍在于病毒在感染肝细胞核内形成的共价闭合环状DNA（cccDNA）分子库。作为病毒生命周期中的关键角色，cccDNA的核内定位、稳定性及其对宿主核环境的影响机制尚不明确。

HBV感染在第五天诱发DNA损伤反应信号

为探究HBV感染对宿主基因组稳定性的影响，研究团队在HepG2-NTCP细胞感染HBV（20个基因组当量，GEQ）后第3天和第5天进行免疫荧光分析。此前研究显示，HBV松弛环状DNA（rcDNA）在感染后1天（1 dpi）开始转化为cccDNA，拷贝数随之增加，至3 dpi时持续上升，并在5 dpi达到平台期，本研究通过cinqPCR技术独立验证了这一动态过程。

通过共聚焦显微镜对磷酸化组蛋白H2AX（γH2AX）焦点进行单细胞分辨率成像，并与HBV核心蛋白共染色以识别病毒感染细胞，发现3 dpi时感染细胞的中位γH2AX焦点数为0.5个，而到5 dpi时显著增加至6.0个。在另一易感细胞系HepaRG中的验证实验进一步证实，HBV感染5天后细胞积累了更多γH2AX焦点。对全细胞裂解物中γH2AX水平的Western blot分析显示，5 dpi时总核γH2AX水平较3 dpi增加三倍，且3 dpi时的水平与模拟感染组相当，表明HBV感染早期的DNA损伤反应（DDR）信号不明显，而rcDNA向cccDNA的转化过程与细胞DDR的诱导密切相关。

HBV感染诱导宿主基因组复制应激

为确定HBV感染是否引发宿主复制应激，研究采用单分子DNA纤维分析（DFA）技术。该技术通过顺序脉冲标记溴脱氧尿苷类似物氯脱氧尿苷（CldU）和碘脱氧尿苷（IdU），来评估基因毒性应激下细胞复制叉的进展情况。在5 dpi时，HBV感染导致细胞复制叉缩短，IdU标记轨道中位长度从模拟感染组的3.42微米降至2.32微米，CldU轨道中位长度从5.40微米降至3.90微米。对复制事件分类显示，HBV感染细胞中新起源点火的比例增加，而进行中的复制叉比例减少，提示病毒感染可能诱导宿主细胞异常的新复制起点激活。

进一步通过微型染色体维持蛋白（MCM）解旋酶复合物磷酸化的抑制剂PHA767491处理，发现其可部分减少新起源点火，但不改变HBV诱导的复制叉缩短，表明HBV引发的复制应激独立于MCM解旋酶活性。通过5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（EdU）脉冲标记实验在HepaRG和HepG2-NTCP细胞中可视化新生DNA合成，同样发现HBV感染5天后每个细胞核内的EdU焦点数显著减少，独立证实了HBV感染削弱了复制叉进程，与前述DDR诱导现象同步发生。

HBV在感染早期触发细胞复制应激

HBV诱导的细胞DDR与5 dpi时观察到的复制应激之间的相关性，促使研究者探究复制应激发生的时间点。通过在不同感染时间点进行DFA，发现宿主复制纤维在感染后1天（1 dpi）即开始缩短，且这种缩短状态持续至2 dpi，IdU和CldU纤维长度保持较低水平。随着感染进展至4 dpi，CldU长度进一步显著下降至2.556微米。复制事件表征显示，1 dpi时进行中复制叉比例即开始下降，2 dpi时进一步降低。

为验证病毒基因组本身是否足以诱导复制应激，研究者用表达HBV前基因组RNA（pgRNA）的质粒（pHBV）转染HepG2细胞，24小时后进行DFA。与空载体对照相比，pHBV转染并未引起显著的细胞复制应激，IdU水平变化不大，CldU长度中位数仅轻微下降，且复制事件比例未发生明显改变，表明仅靠质粒表达的病毒蛋白不足以引发显著的复制应激。然而，考虑到质粒转染在细胞群中的异质性，该结果需谨慎解读。在可诱导HBV复制的HepAD38细胞中，撤除多西环素以启动病毒复制后，DFA显示复制叉长度缩短，说明病毒复制早期事件足以诱导细胞复制应激。研究者推测，这种早期复制应激是后期（5 dpi或之后）感染阶段DDR信号的前奏。

HBV基因组与富含DDIT3结合元件的细胞位点关联

先前研究表明，HBV基因组与转录活跃的染色质区域（A型染色质）相关。为精确追踪cccDNA在宿主基因组上的定位，本研究开发了一种新型高通量染色体构象捕获技术V3C-T5-seq，通过引入T5核酸外切酶处理降解双链线性DNA（dslDNA）和rcDNA，从而特异性保留cccDNA分子进行测序分析。该技术将所需细胞数从传统方法的1000万大幅降至60万，并以BglII作为主要限制性内切酶，捕获了包含HBV所有四个启动子（Cp、Xp、pre-S1、pre-S2）的基因组片段。

通过对比未经处理（HBV）、T5处理（保留cccDNA）及ATR抑制剂berzosertib处理（抑制cccDNA形成）的样本，基因组范围分析显示，80%的HBV相关基因组位点与cccDNA特异性核位点重叠，78%的rcDNA相关位点也与总HBV相关区域重叠。基因组浏览器可视化进一步证实，不同处理条件下的HBV基因组定位峰高度相关，表明存在一批真实的细胞位点供各种形式的HBV基因组存留。

与已发表的HBV定位研究数据进行比较，发现本研究中81%的HBV定位位点位于先前确定的HBV相关染色质域的2兆碱基窗口内，且100%的cccDNA定位位点与之重叠，验证了V3C-T5-seq结果的可靠性。与ENCODE计划中HepG2细胞的染色质谱数据交叉分析显示，21%的携带活性启动子标记H3K4me3和增强子标记H3K27ac的宿主基因组位点与HBV定位相关，但反之，HBV定位位点附近100 kb区域内富含H3K4me3信号，而与H3K27ac的关联性约为50%，提示HBV更倾向于定位在转录活性启动子附近。

对V3C-T5-seq鉴定出的前37个峰值进行生物信息学 motif 分析，发现cccDNA相关位点富含多种宿主转录因子结合基序，包括CTCF、TP53、KLF13、SP5、TBX等，其中DNA损伤诱导转录因子3（DDIT3，亦称CHOP）的基序显著富集。DDIT3此前已被证实与HBV诱导的肝癌相关。免疫荧光-荧光原位杂交（Immuno-FISH）实验验证了HBV基因组与DDIT3蛋白在感染细胞核内的空间共定位，为生物信息学预测提供了实验支持。

DDIT3敲低挽救HBV诱导的复制应激

为探究DDIT3在HBV生命周期中的作用，研究者在HepG2-NTCP细胞中通过RNA干扰（RNAi）敲低DDIT3表达。选择高效敲低的siRNA在感染后第2天转染细胞，于5 dpi时评估对cccDNA形成及宿主复制叉的影响。结果显示，DDIT3的缺失并不影响HBV cccDNA的水平，但显著挽救了HBV诱导的复制叉缩短现象，IdU和CldU轨道长度恢复至模拟感染组水平，且进行中复制叉的比例相应增加。这些发现表明，位于HBV相关细胞位点的DDIT3分子在调节基因组稳定性中扮演重要角色，其存在加剧了HBV诱导的复制应激。

讨论

本研究深入探讨了HBV基因组定位与细胞DNA损伤反应之间的内在联系。HBV感染足以在早期诱发细胞复制应激，这可能是病毒侵入途径、基因组加工及早期病毒蛋白表达等多种因素共同作用的结果。虽然复制应激的具体诱因尚不完全清楚，但其在感染后期（如HepG2-NTCP细胞中5天后）才表现为明显的细胞DDR信号，此时潜伏病毒库已然建立。病毒基因组定位并持续存在于转录活性启动子区域附近，可能通过加剧肝细胞基因组上的转录-复制冲突而恶化复制应激。重要的是，大量HBV定位位点与应激诱导转录因子DDIT3相关，DDIT3缺失可挽救复制应激，提示HBV基因组通过DDIT3依赖性机制加剧细胞DDR。在原发性细胞中，这一过程可能调控致癌进展，最终导致肝细胞癌的发生。

病毒染色体构象捕获技术的应用为了解DNA病毒在核内的定位提供了无偏、高通量的视角。本研究通过整合T5核酸外切酶处理的V3C-T5-seq技术，成功追踪了cccDNA分子在宿主基因组上的定位，发现cccDNA约占所有可检测HBV相关细胞位点的一半。尽管每个感染细胞核内仅存在5-12个cccDNA分子，但其与总HBV定位位点的高度相关性表明存在特定的基因组"热点"区域供病毒基因组汇聚。这些位点大多与转录活跃染色质相关，其中DDIT3的富集及其与HBV基因组的共定位，为理解HBV诱导的DDR、肝硬化及癌变之间的关联提供了新的分子连接。研究者推测，DDIT3介导的活性氧物种（ROS）产生可能加剧宿主复制应激，而后者又是rcDNA向cccDNA转化所必需，这在DDIT3缺失条件下复制应激的挽救中得到间接支持。最终，DDIT3的过度产生可能导致细胞死亡和炎症，在调控失常时促进肿瘤形成。

本研究也存在一定局限性，例如染色体构象捕获技术依赖大量细胞，可能掩盖细胞异质性；无法区分输入病毒基因组、子代病毒基因组或正处于加工状态的基因组；以及难以确定DDR蛋白是与病毒基因组直接结合，还是与病毒组分附近的细胞位点关联。尽管如此，本研究首次揭示了HBV诱导的复制应激始于感染初期并随时间加剧，最终引发细胞DDR信号，且病毒基因组与DDR蛋白共同占据特定的核内区域。HBV基因组与富含重要细胞转录因子（如DDIT3）的转录活性染色质位点的关联，为后续研究HBV如何利用宿主核环境调控基因组稳定性进而参与癌变开辟了新方向。