PRRSV GP2a通过靶向RIG-I的双重机制抑制RLR信号通路：促进K48泛素化降解与劫持ZCCHC3抑制K63激活

《Journal of Virology》：PRRSV GP2a blocks the RLR signaling pathway by targeting RIG-I

本研究揭示了猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）糖蛋白GP2a通过双重机制靶向RIG-I以逃逸宿主天然免疫的新机制：一方面通过促进RIG-I与E3泛素连接酶RNF125相互作用诱导K48连接的多聚泛素化降解；另一方面通过劫持宿主因子ZCCHC3破坏TRIM25-RIG-I复合物形成，抑制K63连接的泛素化激活。该发现深化了对PRRSV免疫逃逸策略的理解，为抗病毒研究提供了新靶点。

　　

PRRSV GP2a blocks the RLR signaling pathway by targeting RIG-I

ABSTRACT

病毒通过靶向RIG-I（Retinoic acid-inducible gene I）干扰干扰素（Interferon, IFN）系统是逃逸宿主天然免疫的有效策略。本研究发现猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）GP2a通过靶向RIG-I抑制IFN产生。进一步研究揭示GP2a通过两种机制阻断RIG-I样受体（RIG-I-like receptor, RLR）信号通路：其一，GP2a通过促进RIG-I与RING finger protein 125（RNF125）相互作用，诱导RIG-I发生K48连接的多聚泛素化（K48-linked ubiquitination）并导致其降解；其二，GP2a劫持锌指CCHC型包含蛋白3（Zinc finger CCHC-type containing 3, ZCCHC3）破坏三联基序包含蛋白25（Tripartite motif-containing 25, TRIM25）-RIG-I复合物形成，从而抑制RIG-I的K63连接的多聚泛素化（K63-linked ubiquitination）。这种抑制作用有效阻止了RIG-I的激活和表达。本研究阐明了PRRSV GP2a抑制IFN产生的新机制，增进了对PRRSV免疫逃逸策略的理解。

IMPORTANCE

猪繁殖与呼吸综合征是影响全球养猪业的重要病毒性疾病。PRRSV糖蛋白（Glycoproteins, GPs）在病毒感染过程中起关键作用。然而，关于PRRSV GPs在拮抗天然免疫应答中的作用仍知之甚少。本研究发现GP2a通过双重机制靶向RIG-I抑制IFN产生：GP2a促进RNF125介导的RIG-I降解，并竞争性相互作用于ZCCHC3以阻碍TRIM25诱导的RIG-I激活。该研究有助于更深入地理解PRRSV所采用的免疫逃逸机制。

INTRODUCTION

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）于1987年首次发现，并迅速传播至全球，给全球养猪业造成重大经济损失。PRRS由PRRSV引起，其特征是母猪的呼吸和繁殖障碍以及仔猪死亡。PRRSV属于套式病毒目、动脉炎病毒科、乙型动脉炎病毒属，是一种单股正链有包膜RNA病毒，基因组大小约为15 kb。PRRSV基因组包含至少10个开放阅读框，编码16种非结构蛋白和8种结构蛋白，包括糖蛋白（GPs）、基质蛋白（Matrix protein, M）和核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein, N）。GP2a与GP3和GP4形成异源三聚体复合物，与CD163相互作用，促进PRRSV进入宿主细胞，从而在PRRSV感染中起关键作用。GP5和M蛋白形成异源三聚体复合物，在病毒附着中起重要作用。N蛋白将病毒基因组包裹在核衣壳内，这一过程对病毒颗粒组装至关重要。

干扰素系统是宿主天然免疫应答的关键组成部分，是抵御病毒感染的第一道防线。病毒感染后，RIG-I发生构象变化以识别病毒RNA。随后，RIG-I与线粒体抗病毒信号蛋白（Mitochondrial antiviral signaling protein, MAVS）相互作用，招募下游信号分子，如TANK结合激酶1（TANK-binding kinase 1, TBK1）和NF-κB激酶ε抑制剂（Inhibitor of NF-κB kinase-ε, IKKε），从而诱导干扰素调节因子3（Interferon regulatory factor 3, IRF3）和IRF7的磷酸化。一旦磷酸化，IRF3和IRF7易位至细胞核，并与CREB结合蛋白（CREB-binding protein, CBP）结合形成转录增强子，刺激IFN转录。随后，IFN激活Janus激酶-信号转导和转录激活因子（Janus kinase-signal transducer and activator of the transcription, JAK-STAT）信号通路，导致干扰素刺激基因（Interferon-stimulated genes, ISGs）的产生。值得注意的是，RIG-I本身是一种ISG，它建立了一个正反馈环路，进一步增加RIG-I的产生。值得注意的是，泛素（Ubiquitin, Ub）系统在调节RIG-I激活中起重要作用。E3泛素连接酶，如TRIM25，通过诱导K63连接的泛素化正向调节RIG-I。这种修饰可以促进RIG-I激活，从而促进IFN产生。相反，一些E3泛素连接酶作为RIG-I的负调节因子。RNF125和TRIM40通过诱导RIG-I的K48连接的泛素化促进其降解，最终抑制IFN产生。此外，RIG-I泛素化受到多种宿主因子的调节。例如，SH3结构域包含激酶结合蛋白1（Src homology 3 domain-containing kinase-binding protein 1, SH3KBP1）和ZCCHC3通过改善RIG-I与TRIM25的相互作用，诱导RIG-I发生K63连接的多聚泛素化。此外，Ras-GTP酶激活蛋白结合蛋白1（Ras-GTPase-activating protein-binding protein 1, G3BP1）与RNF125相互作用促进其降解，从而抑制RNF125介导的RIG-I降解。

先前的研究表明，PRRSV通过破坏IFN系统发展了多种策略来逃逸宿主天然免疫防御。例如，PRRSV非结构蛋白nsp1α通过与TRIM25相互作用抑制IFN产生，从而阻止RIG-I激活。此外，nsp4通过切割NF-κB必需调节因子（NF-κB essential modulator, NEMO）来阻断NF-κB信号通路。Nsp11通过靶向干扰素调节因子9（Interferon regulatory factor 9, IRF9）抑制干扰素刺激基因因子3（Interferon-stimulated gene factor 3, ISGF3）的形成和核转位。此外，nsp11通过内切核糖核酸酶活性降解ISG15。N蛋白通过靶向TRIM25干扰RIG-I激活，并通过阻止其磷酸化和核转位抑制IRF3激活。最近的研究发现PRRSV GPs也在免疫逃逸中发挥作用。具体而言，GP3通过阻断TBK1和IRF3的磷酸化来抑制IFN产生。GP5通过阻断溶酶体相关膜糖蛋白2A（Lysosome-associated membrane glycoprotein 2A, LAMP2A）的K63连接的多聚泛素化来抑制分子伴侣介导的自噬，从而抑制IFN产生。然而，GP2a是否参与PRRSV免疫逃逸仍不确定。

本研究证明GP2a诱导RIG-I降解。然而，GP2a诱导这种降解的具体机制尚不清楚。因此，我们试图解决以下问题：（i）GP2a通过哪条通路诱导RIG-I降解？（ii）GP2a通过什么机制诱导RIG-I降解？（iii）GP2a是否影响RIG-I泛素化？解决这些问题有助于我们更深入地理解PRRSV的免疫逃逸机制。

RESULTS

PRRSV-induced RIG-I degradation

为确定PRRSV对IFN产生和应答的影响，我们初步评估了PRRSV感染是否影响IFN-β和ISG15的表达。用不同感染复数（Multiplicity of infection, MOI）的PRRSV感染Marc-145细胞，收集细胞样本检测IFN-β和ISG15的mRNA水平。与Poly(I:C)组相比，PRRSV并未显著增加IFN-β和ISG15的mRNA水平。PRRSV降低了经Poly(I:C)处理的细胞中IFN-β和ISG15 mRNA的表达。进一步分析感染后不同时间点（hpi）的IFN-β和ISG15 mRNA水平。PRRSV在36和48 hpi时显著抑制IFN-β和ISG15 mRNA的表达。为了进一步验证结果，我们使用酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测培养上清液中的IFN-β水平。与Poly(I:C)组相比，PRRSV感染组在12、24、36和48 hpi时IFN-β的分泌水平显著降低。这些发现表明PRRSV抑制IFN产生。随后，我们研究了PRRSV在信号级联中阻断IFN产生的具体靶点。结果显示PRRSV显著抑制RIG-I表达。为了验证这一发现，用不同MOI的PRRSV感染Marc-145细胞。PRRSV诱导的RIG-I降解随着感染剂量的增加而更加明显。这些发现提示PRRSV通过抑制RIG-I表达来阻断IFN产生。

先前的研究报道PRRSV nsp1α、nsp2、nsp5、nsp11和N蛋白通过靶向RIG-I抑制IFN产生。然而，PRRSV GPs是否参与这种拮抗功能尚不清楚。用编码不同GPs的质粒转染HEK-293T细胞。转染编码N蛋白质粒的细胞作为对照。蛋白质印迹（Western blot）分析显示GP2a显著抑制RIG-I表达。通过ELISA检测PRRSV结构蛋白对IFN-β表达的影响。结果显示GP2a处理显著抑制IFN-β表达。为验证此结果，我们评估了PRRSV GPs对IFN-β和ISG15 mRNA表达水平的影响。GP2a抑制了由Poly(I:C)刺激的IFN-β和ISG15 mRNA表达。这些发现表明PRRSV GP2a在抑制IFN产生中起关键作用。

PRRSV GP2a induced RIG-I degradation through the Ub proteasome pathway

为阐明PRRSV GP2a抑制IFN产生的机制，我们研究了GP2a对IFN-β启动子激活的影响。GP2a抑制了由Poly(I:C)或仙台病毒（Sendai virus, SeV）诱导的IFN-β启动子激活。值得注意的是，GP2a抑制了由RIG-I诱导的IFN-β启动子激活，提示GP2a可能通过靶向RIG-I来阻碍IFN产生。后续分析显示GP2a诱导RIG-I降解并抑制IRF3、IRF7和NF-κB的磷酸化。类似地，GP2a也在Marc-145细胞中诱导RIG-I降解。为验证这些发现，用不同剂量的编码GP2a的质粒转染HEK-293T细胞。结果显示GP2a以剂量依赖的方式显著诱导RIG-I降解。此外，我们通过分析水疱性口炎病毒绿色荧光蛋白（Vesicular stomatitis virus green fluorescent protein, VSV-GFP）的感染效率来检测上清液中的IFN-β产生。在空质粒+Poly(I:C)组中，Poly(I:C)有效刺激细胞产生大量IFN-β，导致VSV-GFP感染被显著抑制。在Poly(I:C)+GP2a组中，GP2a诱导RIG-I降解，从而削弱了Poly(I:C)诱导IFN-β产生的能力。结果显示VSV-GFP的感染效率增强。

PRRSV GP2a promoted K48-linked ubiquitination of RIG-I and inhibited K63-linked ubiquitination of RIG-I

为研究GP2a对RIG-I表达下调的影响，用放线菌酮（Cycloheximide, CHX）处理HEK-293T细胞以抑制RIG-I产生。在转染GP2a的细胞中RIG-I表达降低，提示GP2a在诱导RIG-I降解过程中发挥作用。随后我们检测了GP2a介导的RIG-I降解通路。用MG132（蛋白酶体通路抑制剂）、NH₄Cl（自噬通路抑制剂）或氯喹（CQ，凋亡通路抑制剂）处理细胞。GP2a在经NH₄Cl和CQ处理的细胞中持续诱导RIG-I降解。然而，在经MG132处理的细胞中，这种降解被减弱，意味着MG132有效拮抗了GP2a诱导的RIG-I降解。这些发现表明GP2a通过蛋白酶体途径诱导RIG-I降解。

K63连接的泛素化对RIG-I的激活至关重要，而K48连接的泛素化导致RIG-I的蛋白酶体降解。我们进行了免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation, Co-IP）实验以研究PRRSV GP2a是否促进RIG-I泛素化。正如预期，GP2a促进了Ub与RIG-I之间的相互作用，提示GP2a增加了RIG-I的泛素化。随后，我们鉴定了GP2a诱导的RIG-I泛素化类型。GP2a促进了Ub-K48O（仅含K48的泛素突变体）与RIG-I之间的相互作用，表明GP2a促进RIG-I的K48连接的泛素化。此外，GP2a抑制了Ub-K63O与RIG-I之间的相互作用，表明GP2a抑制RIG-I的K63连接的泛素化。为验证这些发现，我们评估了RIG-I与泛素突变体（Ub-K48R和Ub-K63R）之间的相互作用。GP2a诱导了Ub-K63R与RIG-I的相互作用，并抑制了Ub-K48R与RIG-I的相互作用。这些结果证明GP2a通过促进K48连接的泛素化诱导RIG-I降解，并通过抑制K63连接的泛素化阻止RIG-I激活。

PRRSV GP2a affected the interaction between RIG-I and E3 Ub ligases

先前的研究表明TRIM25在RIG-I的K63连接的泛素化中起关键作用，而TRIM40和RNF125作为负调节因子促进RIG-I的K48连接的泛素化。为进一步阐明GP2a干扰RIG-I泛素化的机制，我们检测了GP2a是否阻断RIG-I与这些E3泛素连接酶之间的相互作用。免疫沉淀实验显示GP2a阻断了RIG-I与TRIM25之间的相互作用，意味着GP2a抑制了TRIM25介导的RIG-I K63连接的泛素化。此外，GP2a通过促进RIG-I与RNF125的相互作用，促进了RNF125介导的RIG-I K48连接的泛素化。后续研究表明GP2a不与E3泛素连接酶或RIG-I相互作用。蛋白质印迹分析显示GP2a不影响TRIM25、TRIM40或RNF125的内源性表达。总之，这些发现表明GP2a破坏TRIM25介导的泛素化并促进RNF125介导的RIG-I泛素化。

为进一步证实GP2a劫持RNF125以促进RIG-I降解的假设，我们合成了小干扰RNA（Small interfering RNAs, siRNAs）来下调RNF125表达。结果显示，在DMEM组和模拟siRNA组中，GP2a分别使RIG-I表达降低了60.8%和62.5%，而在RNF125-siRNA1和RNF125-siRNA2组中，GP2a仅分别使RIG-I表达降低了38.7%和52.3%。这些发现表明GP2a通过劫持RNF125诱导RIG-I降解。

PRRSV GP2a interacted with ZCCHC3

RIG-I泛素化受多种宿主因子调节。我们推测GP2a劫持了影响E3泛素连接酶的未知调节因子。为识别参与此降解过程的潜在宿主因子，我们进行了液相色谱-串联质谱（Liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）分析。该分析识别出228个可能与GP2a结合的潜在因子。基因本体（Gene ontology, GO）富集分析表明RIG-I样受体（RIG-I-like receptor, RLR）信号通路内的基因显著富集，提示PRRSV GP2a通过阻断RIG-I信号通路来抑制IFN产生。随后，我们将质谱结果与各种数据库进行比较，以识别参与GP2a介导的RIG-I降解的潜在宿主因子。使用BioGRID数据库通过生物学分析筛选与RIG-I相互作用的蛋白质。使用Ubibrowser数据库筛选参与RIG-I泛素化和去泛素化的泛素连接酶。此外，利用UniProt数据库系统筛选了文献报道的与RIG-I相互作用的蛋白质。质谱结果与BioGRID数据库的比较分析显示有45个蛋白质重叠。将这45个蛋白质进一步与UniProt数据库交叉引用，识别出5个蛋白质。免疫共沉淀实验证明GP2a与ZCCHC3相互作用。此外，质谱分析结果与Ubibrowser数据库没有重叠，提示GP2a不直接与泛素连接酶相互作用。

接下来，我们研究了ZCCHC3对RIG-I的影响。ZCCHC3促进了RIG-I与Ub(K63O)之间的相互作用，表明ZCCHC3通过促进RIG-I的K63连接的泛素化诱导RIG-I激活。值得注意的是，ZCCHC3上调了RIG-I mRNA并诱导了RIG-I表达。总之，这些结果表明GP2a通过劫持ZCCHC3来靶向RIG-I。

PRRSV GP2a hijacked ZCCHC3 to inhibit RIG-I activation

首先，我们研究了ZCCHC3在RIG-I激活中的具体功能。我们的结果表明ZCCHC3不影响TRIM25、TRIM40或RNF125的表达。后续分析显示ZCCHC3改善了TRIM25与RIG-I之间的相互作用，意味着ZCCHC3促进了TRIM25介导的RIG-I泛素化。此外，ZCCHC3未改变TRIM40、RNF125与RIG-I之间的相互作用，表明它不影响TRIM40和RNF125介导的RIG-I降解。值得注意的是，在过表达ZCCHC3的细胞中，GP2a介导的RIG-I降解减少，突显了ZCCHC3在此降解通路中的关键作用。

随后，我们检测了GP2a对ZCCHC3介导的RIG-I激活的抑制作用。我们的结果表明GP2a不抑制ZCCHC3表达。免疫沉淀实验显示ZCCHC3与TRIM25和RIG-I相互作用，而GP2a破坏了这种相互作用。这些发现表明GP2a与ZCCHC3结合，阻碍了ZCCHC3-TRIM25-RIG-I复合物的形成。进一步分析显示GP2a阻断了ZCCHC3促进的TRIM25与RIG-I之间的相互作用。总之，这些结果表明GP2a通过靶向ZCCHC3抑制TRIM25介导的RIG-I激活。

PRRSV GP2a hijacked ZCCHC3 to inhibit RIG-I production

随后，我们研究了GP2a对ZCCHC3介导的RIG-I产生的潜在抑制作用。为排除ZCCHC3敲低导致RIG-I降解的可能性，向细胞中加入CHX，并在不同时间点收集样本。ZCCHC3敲低细胞中RIG-I的降解速率与阴性对照相当，表明ZCCHC3敲低不导致RIG-I降解。值得注意的是，ZCCHC3敲低导致RIG-I表达下降，意味着ZCCHC3对RIG-I的产生至关重要。

RIG-I K63连接的泛素化抑制有效阻碍RLR信号通路，从而抑制ISGs的产生并最终减少RIG-I产生。我们随后探讨了GP2a是否通过相互作用于ZCCHC3来抑制RIG-I产生。值得注意的是，在DMEM组和模拟siRNA组中，GP2a分别使RIG-I表达降低了64.1%和62.7%。相反，在ZCCHC3-siRNA1和ZCCHC3-siRNA2组中，GP2a仅分别使RIG-I表达降低了45.8%和44.7%。这些发现表明GP2a抑制RIG-I产生，而ZCCHC3敲低削弱了GP2a抑制RIG-I产生的能力。

我们假设ZCCHC3通过促进TRIM25介导的RIG-I激活来诱导RIG-I产生，而GP2a劫持ZCCHC3以抑制RIG-I产生。为验证此假设，我们合成了siRNAs来下调TRIM25表达。在DMEM组和模拟siRNA组中，GP2a分别使RIG-I表达降低了45.5%和49.2%，而在TRIM25-siRNA1和TRIM25-siRNA2组中，GP2a仅分别使RIG-I表达降低了38.1%和38.5%。这些发现表明GP2a劫持ZCCHC3以抑制TRIM25介导的RIG-I激活，从而阻止RIG-I产生。

此外，进行了免疫沉淀实验以排除TRIM25和ZCCHC3敲低导致RNF125介导的RIG-I降解的可能性。TRIM25和ZCCHC3的敲低并未增强RNF125与RIG-I之间的相互作用。此结果提示GP2a劫持ZCCHC3以阻断RIG-I激活和产生的功能与其促进RNF125介导的RIG-I降解无关。

Identifying the key amino acid sites of GP2a that induce RIG-I degradation

使用AlphaFold生成GP2a和ZCCHC3的预测结构，以识别GP2a中促进其与ZCCHC3相互作用的关键氨基酸。使用对接网络服务器（Docking Web Server, GRAMM）进行蛋白质-蛋白质对接，并使用PyMOL预测和可视化GP2a与ZCCHC3之间的相互作用。结果表明Tyr59、Arg121、Val229和Arg239是GP2a与ZCCHC3结合的关键残基。序列比对分析显示这些氨基酸在不同毒株间是保守的，表明GP2a与ZCCHC3相互作用的功能是保守的。为确认此结果，我们分析了不同PRRSV毒株的GP2a蛋白是否具有相同效果，发现它们都抑制RIG-I表达。为评估这些保守氨基酸位点的功能意义，将它们突变为丙氨酸以生成编码GP2a_mut的质粒。正如预期，GP2a_mut不抑制由Poly(I:C)刺激的IFN-β和ISG15 mRNA表达。GP2a_mut抑制RIG-I产生的能力减弱。GP2a_mut不促进RIG-I泛素化。免疫沉淀实验显示GP2a_mut不与ZCCHC3相互作用。总之，这些发现强调了Tyr59、Arg121、Val229和Arg239作为GP2a劫持ZCCHC3的关键残基的重要性。

GP2a inhibits the function of ZCCHC3 in suppressing PRRSV replication

我们研究了ZCCHC3对IFN活性的影响。结果表明ZCCHC3过表达显著促进IFN-β的产生，而在ZCCHC3敲低细胞中IFN-β水平降低。我们进一步研究了ZCCHC3在PRRSV复制中的作用。使用已知促进PRRSV复制的DDX3X作为阳性对照。DDX3X在感染早期增加PRRSV滴度，而ZCCHC3显著降低PRRSV滴度。值得注意的是，GP2a抑制了ZCCHC3抑制PRRSV复制的能力。我们的发现通过免疫荧光 assay（Immunofluorescence assay, IFA）结果得到进一步验证。此外，ZCCHC3抑制了PRRSV诱导的IFN应答抑制。这种抑制作用在过表达GP2a的细胞中减弱。总之，我们的发现表明ZCCHC3作为抗PRRSV的病毒因子，而GP2a抵消了这种抗病毒功能。

DISCUSSION

病毒已发展出复杂的策略来逃逸宿主的天然免疫应答。其中最有效的策略之一是通过靶向RIG-I来抑制IFN产生。人乳头瘤病毒E6蛋白促进TRIM25的K48连接的泛素化，导致其降解并抑制TRIM25介导的RIG-I激活。严重急性呼吸综合征冠状病毒2（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2）的非结构蛋白5切割RIG-I以破坏RIG-I-MAVS复合物的形成。此外，SARS-CoV-2 N蛋白与G3BP1相互作用以阻断G3BP1介导的RNF125降解，从而诱导RIG-I降解。口蹄疫病毒2B蛋白招募RNF125以促进RIG-I降解。类似地，PRRSV通过靶向RIG-I进化出破坏IFN系统的策略。Nsp1α和N蛋白劫持TRIM25以抑制TRIM25介导的RIG-I激活。Nsp2与SH3KBP1相互作用诱导自噬降解，最终抑制RIG-I的K63连接的泛素化。Nsp11抑制RIG-I的表达。在本研究中，我们观察到PRRSV显著诱导RIG-I降解，其中GP2a在此过程中起关键作用。进一步研究揭示GP2a通过泛素-蛋白酶体途径介导RIG-I降解。具体而言，GP2a通过促进RIG-I与RNF125的相互作用，增强RIG-I的K48连接的泛素化。值得注意的是，GP2a不直接结合RNF125，意味着GP2a通过间接机制调节RNF125与RIG-I之间的相互作用。阐明GP2a诱导RIG-I降解所涉及的具体机制至关重要。

RIG-I的激活依赖于TRIM25介导的K63连接的泛素化，这对启动天然免疫应答至关重要。在本研究中，我们观察到ZCCHC3招募TRIM25以促进TRIM25-RIG-I复合物的形成，从而增加RIG-I的K63连接的泛素化。此外，ZCCHC3不影响RIG-I与RNF125或TRIM40的相互作用，表明ZCCHC3不干扰RIG-I降解。PRRSV GP2a不影响ZCCHC3表达。后续研究揭示GP2a劫持ZCCHC3以抑制RIG-I激活。具体而言，GP2a与ZCCHC3相互作用以破坏ZCCHC3与TRIM25之间的相互作用。这种破坏抑制了TRIM25介导的RIG-I K63连接的泛素化，从而阻止RIG-I激活。

据信IFN-β通过正反馈机制促进RIG-I产生。许多研究强调了此反馈环路的重要性。IFN诱导的RIG-I表达上调随后诱导抗病毒蛋白的激活和IFN的产生。这种调节机制确保在利用RIG-I检测到病毒感染时，IFN系统被迅速激活以抑制病毒传播。在本研究中，我们观察到TRIM25和ZCCHC3的敲低导致RIG-I产生减少，表明K63连接的泛素化对RIG-I产生至关重要。ZCCHC3通过增强TRIM25介导的RIG-I K63连接的泛素化诱导IFN产生。随后，IFN激活JAK-STAT信号通路诱导ISGs的表达，最终促进RIG-I产生。PRRSV GP2a劫持ZCCHC3以抑制RIG-I的K63连接的泛素化，破坏RIG-I正反馈环路，从而抑制RIG-I产生。总之，这些发现提示GP2a通过劫持ZCCHC3来减少RIG-I产生。

PRRSV的特点是遗传变异性高，并且GP2a序列在不同PRRSV毒株间存在差异。在本研究中，我们使用GRAMM软件对GP2a和ZCCHC3进行对接分析，识别出Tyr59、Arg121