硕大利什曼原虫UDP-糖焦磷酸化酶反应后结构揭示产物释放机制

本综述通过高分辨率X射线晶体学揭示了硕大利什曼原虫UDP-糖焦磷酸化酶（USP）在反应后状态的结构特征，首次阐明了焦磷酸（PPi）释放通道的构象变化机制。研究发现功能环区（铰链环1/2、核苷酸结合环）的动态重构及镁离子（Mg2+）的亚稳态结合位点，通过分子动力学模拟验证了产物释放路径，为开发针对锥虫特异性糖核苷酸代谢通路的抑制剂提供了新靶点。

　　

ABSTRACT

锥虫类寄生虫中尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-Glc）和尿苷二磷酸半乳糖（UDP-Gal）的生物合成通过UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UGP）和UDP-糖焦磷酸化酶（USP）协同调控。USP具有广谱底物特异性，可在体外生成多种UDP-糖。本研究通过解析硕大利什曼原虫USP（LmUSP）反应后状态的高分辨率X射线结构，揭示了焦磷酸（PP_i）的多重结合位点及产物释放通道的构象变化。

INTRODUCTION

利什曼原虫依赖糖萼中的碳水化合物适应宿主环境。糖-1-磷酸核苷酸转移酶通过有序双向催化机制激活单糖生成糖核苷酸。USP作为尿苷酸转移酶亚家族成员，在原生动物和植物中通过底物拯救途径回收单糖。在葡萄糖匮乏条件下（如沙蝇肠道），USP通过激活半乳糖-1-磷酸（Gal-1P）合成UDP-Gal，维持寄生虫关键糖缀合物的生物合成。

RESULTS

The post-reactive state structure of LmUSP

通过共结晶与PP_i浸泡技术获得2.4 ?分辨率结构。电子密度图显示UDP-Glc与PP_i的两种结合构象（位置1和2）。核苷酸结合环（NB-loop）中E126侧链110°翻转引发活性中心半开放构象转变，形成PP_i释放通道。

UDP-Glc has a constricted geometry in the post-reactive state

比较UDP-Glc结合状态（PDB: 3OH4）发现，反应后状态中磷酸基团的O5C-Pα-O3α和O3β-Pβ-O3α键角分别缩小至103.3°和104.9°。葡萄糖O6原子远离K434向Y430偏移，削弱糖基结合力，启动产物解离。

The PP_i binding sites reveal a series of post-reactive Michaelis product complexes

PP_i（1）结合于由K387/K398/R401/K220形成的正电沟槽，K398侧链112°翻转形成分子门控。PP_i（2）位于蛋白表面，由K397/K398稳定，代表解离前状态。未观察到Mg²⁺结合，表明金属离子优先解离。

Mg²⁺ accompanied PP_i release/entry

正交钒酸盐（VO₄）模拟磷酸基团与Mg²⁺共结晶结构（2.2 ?）证实PP_i（1）位点为金属离子协同结合位点，构象变化与PP_i复合物一致。

Positively charged residues guide PP_i release/entry

100 ns分子动力学模拟显示，R127/K220/K387/K397/K398/R401通过动态氢键引导PP_i在活性中心与表面间移动。PP_i:P1与UDP-Glc:Pβ最短距离达7.4 ?（91.6 ns），接近LmUGP反应后状态（PDB: 4M2A）。

DISCUSSION

本研究填补了USP催化循环中产物释放阶段的空白。NB-loop构象变化开启PP_i屏蔽通道，铰链环动态重构形成正电引导路径。与人类UGP相比，USP的PP_i释放通道残基具有物种特异性，为选择性抑制剂设计提供依据。单Mg²⁺协同机制与LmUGP类似，区别于双金属离子依赖的细菌UGP。该释放机制在USP家族中具有保守性，完善了对锥虫尿苷酸转移酶催化机制的理解。

MATERIALS AND METHODS

野生型LmUSP通过气相扩散法结晶，使用含UDP-Glc的缓冲体系（pH 5.4-5.6）。同步辐射数据在EMBL P13线站收集，通过分子置换解析结构。分子动力学模拟采用NAMD软件与AMBER力场，在周期性边界条件下进行100 ns轨迹分析。