基于异丙醇和基质管的高效核酸与代谢物同步提取方法在低/高生物量样本中的应用验证

本研究提出了一种基于异丙醇保存和基质管（Matrix Tube）的样本处理方法，通过优化珠磨裂解方案（混合0.1/0.5/1 mm珠子）和验证95%异丙醇作为乙醇替代保存剂，实现了从单一样本中同步提取代谢组（LC-MS/MS）和宏基因组（16S/shotgun）数据。该方法将处理时间减半，显著降低样本间交叉污染，并证明异丙醇在室温保存中与乙醇效果相当，为大规模微生物组研究提供了自动化友好、高保真的技术路径。

　　

ABSTRACT

群体研究的关键在于临床环境外的样本采集。微生物种群具有高度动态性，其组成随宿主、环境及时间点显著变化，仅靠临床采样难以全面捕捉。家庭样本收集能够纳入更广泛、更多样化的参与者群体，涵盖种族、年龄等因素差异。然而，大样本研究的管理因样本获取、处理和分析的复杂性而充满挑战。

基于先前证明单支1 mL带条形码的基质管（Matrix Tubes）在减少样本处理时间和孔间污染方面的有效性，本研究进一步验证了该方法与之前基准化的板式方法（使用相同提取试剂）的对比。验证重点包括建筑环境、人类皮肤、人类唾液以及小鼠和人类粪便样本。重要的是，我们探讨了珠磨裂解步骤中使用混合珠子尺寸的影响，证明其相比单一珠子尺寸能提高分类单元回收率。最后，我们评估了95%异丙醇用于室温样本保存的潜力。结果表明，异丙醇在许多情况下与95%乙醇表现相当，建议在乙醇不可用时作为可行替代方案。除了最大限度减少污染、将处理时间减半、消除样本铺板过程中的人为错误以及简化元数据管理外，基质管方法产生的代谢组学、16S和鸟枪法宏基因组数据与板式方法对高、低生物量样本均具有一致性。

IMPORTANCE

许多研究已将微生物组与人类及环境健康联系起来，但许多基本问题仍未解答。需要在混杂因素背景下，通过具有强大统计效力的大规模研究来确定重要的协变量。交叉污染、有限通量和人为错误已被确定为处理大量样本时的重大障碍。我们提出了一种用于样本登记以及从高、低生物量样本中提取代谢物和DNA的简化方法。该方法先前已被证明能显著减少交叉污染，并采用自动化友好的单一样本单管条形码系统。此外，我们证明95%异丙醇可作为许多样本类型的有效常温保存溶液，在乙醇不可用或受限制的地区提供了一种替代方案。该方法对该领域具有重要意义，使得在乙醇成本更高或不可用的情况下，大规模研究能够以更高的效率和可及性产生准确的见解。

INTRODUCTION

微生物组研究不断揭示其与人类健康和环境可持续性的重要联系。然而，需要具有高统计效力的大规模研究来区分真实的关联与混杂因素。一个关键挑战是微生物群落的动态性质，其在不同宿主、环境和时间点之间存在差异，这种变异性仅靠临床采样无法完全捕捉。因此，在临床环境外收集样本对于群体研究至关重要，能够实现更广泛的参与者多样性和更具代表性的数据集。家庭收集扩大了参与者多样性，纳入了种族和年龄等因素的差异。然而，大规模研究在样本获取、保存、处理和分析方面面临挑战。

我们先前证明，使用1 mL带条形码的试管能显著减少样本间的孔间污染，并可从单管样本中同时提取核酸和代谢物。这种方法被称为基质方法（Matrix Method），已被证明可将处理时间减半，并能与自动化基础设施无缝集成。小分子代谢物和微生物DNA提取通常使用生物学重复分别进行，这使得样本登记和元数据管理耗时、易出错，并降低了每种提取方法所得数据之间的相关性。代谢组学和宏基因组数据的高通量整合加速了揭示这些关联背后分子机制的发现。先前基准化的板式方法（Plate-based Method）耗时且劳动密集型，需要手动将拭子头转移到两个独立的96深孔板中——一个用于代谢组学，另一个用于宏基因组学。使用相同的核酸提取试剂（即来自Thermo MagMAX Microbiome Ultra 96样本试剂盒），我们改进的1 mL基质方法消除了这一繁琐的样本铺板步骤。它采用了一种自动化开合系统，使用单独的、带条形码的、 racked 的试管，称为基质管（Matrix tubes）。一个架上的所有96支试管可以使用高速条形码阅读器（VisionMate）一次性扫描。与板式方法（每个样本需单独铺板和扫描）相比，这提供了主要的速度优势。通过消除板式方法的样本铺板步骤，也消除了该步骤引入的错误。此外，样本完全包含在单独的试管中，防止了样本均质化和细胞裂解过程中任何样本泄漏到相邻样本中。因此，基质方法能够从单个拭子或200 μL样本中进行代谢组学和DNA提取，且可靠、省力、经济、高效。

我们之前的工作强调了基质方法在减少人类粪便样本测序中的人为错误、处理时间和孔间污染方面的益处。同样，我们之前证明了基质方法在样本储存和进行非靶向代谢组学提取方面的效用。使用95%乙醇代替50%甲醇更安全（即允许家庭样本收集）并降低成本（即可在室温下储存和运输）。在此，我们通过探索在细胞裂解步骤中加入不同珠子尺寸以减少分类单元偏差的潜在益处，并验证第三种保存溶液在更广泛样本类型（除人类粪便外）中的应用，进一步扩展了基质方法的实用性。

为了增加核酸提取过程中的分类单元回收率，我们在细胞裂解过程中加入了三种不同尺寸的珠子，预计这将从更广泛的细胞尺寸范围内增加DNA产量。我们倾向于使用机械方法而非酶促裂解，因为尽管酶（如几丁质酶）可以增加从某些真菌的纯培养物中的回收率，但酶促裂解也被证明会降低总DNA产量，并且已知会引入分类单元偏差。与酶促裂解相比，珠磨裂解具有更低的成本和更短的处理时间，并且是环境样本无分类偏差裂解的金标准。

为了进一步减少物流挑战和样本运输成本，一种能在环境温度下长时间稳定微生物群落的储存溶液至关重要。在此，我们将样本在95%（体积/体积）异丙醇中的储存与之前基准化的95%（体积/体积）乙醇标准在室温下储存一周进行比较。乙醇先前已被证明能在室温下充分保存样本长达八周，并且是代谢物提取的合适溶剂。然而，乙醇有时不可用，并且在某些情况下，由于用于饮料而具有额外的限制。在这些情况下，异丙醇由于其可获得性更稳定、成本通常更低且更稳定、以及相对于乙醇的监管更少，可以作为一种可靠的替代品。为了验证基质方法中修改的细胞裂解步骤，并研究95%异丙醇作为样本储存缓冲液的潜力，我们进行了这项研究，以直接比较更新后的基质方法与板式方法。具体来说，我们比较了DNA产量、高质量序列数量、微生物α和β多样性以及微生物分类组成。我们针对储存在95%乙醇或95%异丙醇中的样本测试了每种方法，样本类型包括建筑环境表面、人类皮肤、人类唾液以及小鼠和人类的粪便。为了将我们的发现扩展到非靶向代谢组学（即LC-MS/MS），我们还仅针对基质方法比较了95%乙醇和95%异丙醇之间的代谢物α和β多样性及组成。

RESULTS

我们总共处理了来自4名人类和4只小鼠的粪便样本；来自4名人类受试者腋窝和手部的皮肤拭子；来自3名人类受试者在刷牙前后收集的唾液样本；来自加州大学圣地亚哥分校研究设施内四个不同区域的表面样本；以及来自四个不同个人拥有的键盘拭子。

我们发现，除人类手部皮肤拭子外（对于该样本类型，在基质方法中，储存在乙醇中的样本比储存在异丙醇中的样本产生略多的DNA），所有样本类型的DNA产量在样本储存缓冲液（即异丙醇和乙醇）和提取方案（即基质方法和板式方法）之间具有可比性。当比较相同样本在不同储存缓冲液但使用相同提取方案的重复样本之间的DNA产量时，我们发现了强烈的正相关性，并且在储存在乙醇或异丙醇的样本之间没有差异。然而，我们注意到在使用板式方法时，乙醇回收更多DNA的轻微趋势。

我们还发现，对于16S扩增子和鸟枪法宏基因组测序数据，在不同储存缓冲液和提取方案的重复样本之间，测序读数计数呈强正相关且具有可比性。我们注意到，在使用基质方法提取时，储存在乙醇和异丙醇中的重复样本之间的16S读数计数相关性略强但差异更大。而在我们的鸟枪法宏基因组数据中，使用基质方法时相关性略弱、差异略大。

在考虑微生物群落多样性时，我们发现α多样性（即Faith系统发育多样性[PD]）的估计值在提取方法之间高度相关，无论使用何种储存缓冲液，对于16S和鸟枪法宏基因组数据都是如此。我们注意到一个趋势，即基质方法从低生物量样本中捕获的微生物分类单元多样性高于板式方法，尤其是在我们的16S数据中。我们还发现，对于16S和鸟枪法宏基因组数据，在使用相同方法提取但储存在不同缓冲液中的重复样本之间，α多样性高度一致。相反，对于LC-MS/MS代谢组学数据，当比较使用基质方法提取的、储存在乙醇与异丙醇中的相同样本重复之间的代谢物丰富度时，乙醇似乎比异丙醇从低生物量样本中捕获了更多样性的特征。我们重申，代谢组学仅对使用基质方法提取的样本进行；因此，我们仅呈现关于所有样本类型的储存溶液的结果。

为了开始理解样本储存缓冲液和提取方法对β多样性（即样本间距离）的影响，我们首先检查了相同样本的重复样本之间的相似性如何随方法变化。总体而言，对于我们的微生物数据集，重复样本之间的变异通常对于低生物量样本类型更大，并且在所有样本中使用基于丰度的距离度量时比使用基于存在/缺失的度量时更为明显。对于16S和鸟枪法宏基因组数据，我们观察到不同方法间的差异取决于样本类型和距离度量。例如，在我们的16S数据中，当使用未加权UniFrac距离和phylo-RPCA时，我们观察到使用板式方法和基质方法提取的腋窝皮肤样本之间的距离相似，但在使用Jaccard和加权UniFrac距离时，方法之间的值不同。相比之下，对于我们的代谢组学数据，我们观察到腋窝皮肤样本和地板瓷砖拭子样本在不同储存溶液之间的β多样性存在一致差异，并且对于电脑键盘拭子，在四种距离度量中的两种下也存在差异。

然后，我们使用Mantel检验比较了经受不同储存溶液和提取方案的相同样本重复之间的β多样性。总体而言，储存缓冲液和提取方法之间的Mantel相关性在几种不同的距离度量下都很强，并且对于高生物量样本类型比低生物量样本类型更强。对于16S数据，对于储存缓冲液和提取方法，我们观察到在高生物量样本类型中使用加权UniFrac时的相关性较弱，而在低生物量样本类型中使用基于存在/缺失的距离度量时比使用基于丰度的度量时相关性较弱。对于鸟枪法宏基因组数据，我们在高生物量样本类型中观察到相同的模式，但在低生物量样本类型中，基于丰度的度量比基于存在/缺失的距离度量的相关性更弱。相比之下，我们观察到使用基质方法提取的不同储存缓冲液之间的LC-MS/MS代谢组学谱相关性较弱，特别是对于低生物量样本，尽管除Robust-Aitchison PCA（RPCA）外，所有距离度量都具有统计学显著性。

为了进一步审视不同储存缓冲液和提取方法的使用如何影响微生物群落组成，我们使用置换多元方差分析（PERMANOVA）评估了这些因素对β多样性的影响。对于16S和鸟枪法宏基因组数据，我们观察到提取方法和宿主身份对低生物量和高生物量样本类型的影响存在主要差异。对于高生物量样本类型，宿主身份的影响最强，并且是唯一被发现显著的因素，除了人类口腔拭子。仅针对评估的五种距离度量之一（即加权UniFrac），我们的16S数据显示，对于刷牙前的口腔拭子，样本储存缓冲液的影响几乎与宿主受试者一样强。尽管影响很小，但刷牙后的口腔拭子受到提取方法的影响。我们的鸟枪法宏基因组数据也表明，刷牙前的口腔拭子受到样本储存缓冲液的强烈影响；然而，刷牙后的口腔拭子不受提取方法影响，而是受储存缓冲液影响，同样仅针对加权UniFrac距离。

对于低生物量样本类型，我们观察到样本储存缓冲液和提取方法的显著影响取决于数据类型（即16S与鸟枪法宏基因组）、距离度量和样本类型。我们的16S数据表明，人类皮肤（腋窝和手部）拭子受到提取方法的影响——使用基于存在/缺失的距离度量时，其影响与宿主身份相似，但使用基于丰度的度量时影响较弱。地板瓷砖拭子也受到提取方法的影响，使用大多数距离度量时，其影响与宿主身份相似，但使用RPCA时是唯一显著的因素。键盘拭子仅受提取方法影响（即没有宿主身份的影响），使用基于存在/缺失的距离度量时影响较小，但使用基于丰度的度量时影响较强。我们的鸟枪法宏基因组数据表明，腋窝拭子受到提取方法的影响程度与宿主身份大致相同；而对于手部拭子，提取方法的影响弱于宿主身份，尽管对于除UniFrac和phylo-RCPA之外的所有距离度量均显著。与我们的16S数据相似，鸟枪法宏基因组学揭示了对地板瓷砖拭子的提取方法和宿主身份均有显著且相似的影响。鸟枪法宏基因组学还揭示了在使用加权UniFrac距离时，地板瓷砖拭子的样本储存缓冲液有微弱但显著的影响。类似地，我们发现键盘拭子没有宿主身份的影响，并且对于除加权UniFrac之外的所有距离度量，样本储存缓冲液和提取方法之间存在显著的交互作用。

当使用PERMANOVA评估样本储存缓冲液对LC-MS/MS代谢物组成的影响时，我们发现只有宿主身份是高生物量样本类型的显著因素，其影响因具体样本类型和距离度量而异。对于低生物量样本类型，宿主身份的影响常常缺失，并且仅对某些距离度量的腋窝拭子显著。然而，样本储存缓冲液的影响对于腋窝拭子、使用Jaccard距离时的手部拭子以及表面拭子是显著的。

为了进一步探索从用不同储存溶液和处理方法处理的样本中回收特定微生物和代谢物的偏差，我们进行了分析以揭示哪些特征是任何单一方法所独有的。对于微生物，我们使用鸟枪法宏基因组数据来探索古菌、细菌和真菌的分类单元偏差。当在Web of Life系统发育树上可视化这些模式时，我们发现虽然大多数物种在所有方法中都被回收，但许多是某种方法所独有的，其中大多数独有微生物是从储存在乙醇中并使用基质方法提取的样本中回收的。例如，虽然放线菌门（Actinomycetota）通常在所有方案中都能很好地回收，但拟杆菌门（Bacteroidota）中早期分化的支系以及假单胞菌门（Pseudomonadota）中散布的几个类群显示出对单一方法的强烈亲和性，其中大多数类群是从储存在乙醇中并使用基质方法提取的样本中回收的。当我们量化这些差异时，我们发现，除了在所有方法中回收的物种总数最多之外，储存在乙醇中随后使用基质方法提取，从所有检查的样本类型中回收了最多的独特物种，除了那些来自人类口腔的样本。对于后者，储存在异丙醇中回收了最多的独特物种，随后使用板式方法和基质方法提取分别从刷牙前和刷牙后收集的样本中回收了最多的独特类群。

对于真菌，储存在乙醇中随后使用基质方法提取，从所有检查的样本类型中回收了最多的属，除了人类粪便（储存在异丙醇与乙醇中分别回收了13个和12个真菌属）和刷牙前的人类唾液（储存在异丙醇中随后使用板式方法提取回收了13个属，而其他方法回收了8或9个属）。对每个属的子集检查表明，每种方法回收了相似但独特的真菌组合。同样，对于回收的独有真菌属的数量，储存在乙醇中随后使用基质方法提取从所有检查的样本类型中回收了最多的真菌属，除了人类粪便（储存在异丙醇中回收了13个属，而储存在乙醇中回收了12个属）和刷牙前的人类唾液（储存在任一溶液中随后使用板式方法提取回收了3个独有真菌属，而使用基质方法时回收了1个）。我们注意到，对于大多数样本类型，任一种提取方法都回收了至少一个独有真菌属，但基质方法在人类粪便和刷牙后唾液方面在这方面是独特的。

为了识别哪些真菌属在不同方法间表现出可变的回收率，并且在缺乏真菌综合系统发育的情况下，我们检查了用于分类单元偏差分析的丰度表的热图。最普遍存在的分类群是马拉色菌属（Malassezia）和青霉菌属（Penicillium），它们从除储存在异丙醇中使用板式方法提取的小鼠粪便，或储存在乙醇中使用基质方法提取的小鼠粪便之外的所有样本中回收。类似地，曲霉菌属（Aspergillus）从除储存在乙醇中使用板式方法提取的小鼠粪便，以及储存在任一溶液中并使用板式方法提取的人类粪便之外的所有样本中回收。我们还探索了哪些真菌属仅从一种提取方法中回收（即独有属）。少数真菌仅在使用板式方法时被回收，包括从刷牙前人类唾液中的链格孢属（Alternaria）和外瓶霉属（Exophiala），以及从小鼠粪便中的 Hir sutella 属。更常见的是，某些真菌属仅在使用基质方法时被回收。评估每个样本类型的排他性然后跨类型统计，这些独有真菌属中的大多数是从储存在乙醇中的样本中回收的，而不是异丙醇，并且是使用基质方法提取的，而不是板式方法。具体来说，储存在乙醇中随后使用基质方法提取回收了73个独有真菌属，而储存在异丙醇中随后使用基质方法提取仅回收了28个独有属。类似地，储存在乙醇中随后使用板式方法提取回收了46个独有真菌属，而储存在异丙醇中随后使用板式方法提取回收了27个独有属。

对于代谢物，我们观察到关于储存溶液的回收偏差类似模式，其中乙醇比异丙醇回收了更多的总代谢物和更多的独有代谢物，从所有检查的样本类型中，除了那些来自人类口腔的样本。对于电脑键盘表面，储存在异丙醇中回收的代谢物数量仅为储存在乙醇中的一半。对于刷牙后的人类唾液、腋窝皮肤和电脑键盘表面，不同储存溶液之间独有代谢物数量的差异接近两倍。我们注意到，仅对于表面样本，每种储存溶液回收的独有代谢物数量都超过了两种溶液共同回收的数量。考虑到代谢物的身份，乙醇与异丙醇相比回收更多代谢物的情况对于低生物量样本类型更为显著。例如，亚类“氨基酸、肽和类似物”、“芳基溴化物”、“神经酰胺”和“四萜类”在所有低生物量样本类型中在乙醇储存后富集。储存溶液之间可变回收的其他亚类包括人类粪便中的“苯甲酸及其衍生物”、“胆汁酸、醇及其衍生物”和“脂肪酸及其结合物”；小鼠粪便中的“脂肪醇”和“羟基肉桂酸及其衍生物”；刷牙前人类唾液中的“碳水化合物和碳水化合物结合物”；以及刷牙后人类唾液中的“苯甲酸及其衍生物”和“脂肪醇”。

DISCUSSION

在这项研究中，我们将基质方法与先前建立的板式方法在多种微生物组相关样本类型的DNA和代谢物提取方面进行了基准测试。我们的发现支持先前的结论，即基质方法是高通量微生物组研究中一种稳健、可扩展且经济高效的替代方案。基质方法的关键优势在于其与自动化的兼容性、降低的污染风险以及从单一样本管简化宏基因组和代谢组工作流程的能力。

在DNA产量方面，我们观察到板式方法比基质方法产生更多DNA的轻微趋势，以及在每种提取方法中乙醇优于异丙醇的轻微趋势。前一个观察结果可能归因于方法之间拭子的差异，因为板式方法使用的拭子具有更大的采样表面。尽管如此，储存在不同储存溶液和/或使用不同方法提取的样本的测序读数计数高度相关。方法之间的相关性对于16S数据略强于鸟枪法宏基因组数据，这可能源于后者更高的分类分辨率。类似地，群落多样性分析的结果表明，来自每种储存溶液和/或提取方法的微生物组数据高度一致。然而，对于除人类口腔样本之外的所有样本类型，储存在乙醇中随后使用基质方法提取导致最高的α多样性和最高比例的独特分类单元。基质方法在这方面对低生物量样本类型的更好性能尤其明显。我们怀疑使用基质方法时分类单元回收率的增加是由于本研究中引入到该方案中的修改的裂解步骤，我们预计这将裂解更广泛的微生物。

微生物群落组成在16S和鸟枪法宏基因组数据的提取方案和储存溶液之间高度一致，表明两种方案均未对古菌和细菌的分类组成引入显著偏差。然而，所有检查β多样性的方法都显示低生物量样本类型的重复样本之间对应性较弱，反映了收集和处理此类样本的固有挑战。有趣的是，对于我们的16S数据，低生物量样本类型在使用基于丰度的距离度量时Mantel相关性更强，而对于我们的古菌和细菌鸟枪法宏基因组数据，在使用基于存在/缺失的度量时相关性更强。这种差异可能源于分类分辨率的差异或使用读数计数作为丰度代理的可靠性变化，具体取决于数据类型。

PERMANOVA的结果最好地突出了不同储存溶液和提取方法对低生物量样本类型的影响。对于微生物，人类口腔样本似乎受到样本储存缓冲液和/或提取方法的影响，尽管刷牙后样本的结果不太清晰，这可能源于口腔卫生活动后微生物负荷较低，这似乎得到了我们α多样性分析的支持（即刷牙前古菌+细菌分类单元总数大于刷牙后），除了样本储存在异丙醇中使用基质方法提取的情况。值得注意的是，对于键盘表面，提取方案成为影响β多样性的主导因素，强调了低生物量环境对方法学变异的敏感性。我们假设大量重复拭子使得难以在样本之间保持一致性，特别是对于键盘，每个键代表一个小的表面区域，可能具有独特且可能有限的微生物负荷，这取决于使用频率和模式。这对于基质方法可能尤其明显，该方法先前已被证明可以减少样本间污染，否则可能会同质化具有不同微生物群落组成的样本，特别是对于α多样性相对较低的群落。作为支持，尽管并非在所有距离度量中都一致，但我们观察到在使用基质方法提取的键盘表面拭子的16S数据中，低生物量样本之间的β多样性更大，并且在人类皮肤拭子的鸟枪法宏基因组数据中，对于大多数检查的距离度量，使用基质方法时β多样性更大。

我们的分类单元偏差分析支持储存在乙醇中随后使用基质方法提取是从所有样本类型（除人类口腔外）回收古菌、细菌和真菌的最佳方案。对于那些样本类型，刷牙前的唾液中更多的古菌物种、细菌物种和真菌属是在储存在异丙醇中使用板式方法提取时回收的。此外，刷牙后的唾液中更多的古菌和细菌物种是在储存在异丙醇中使用基质方法提取时回收的。我们注意到，在某些分类单元的可变回收与特定方法不一致的情况下，特别是对于低生物量样本，对特别低丰度分类单元回收的比较可能会受到低微生物负荷和有限样本量的混淆。

虽然间接，但我们的分类单元偏差分析结果支持在基质方法固有的核酸提取样本裂解过程中使用三种不同珠子尺寸（0.1、0.5和1 mm）的混合物。这种方法可能比板式方法中使用的单一尺寸（即0.1 mm）更有效地裂解形态和尺寸范围广泛的微生物繁殖体集合。作为支持，我们发现对于小鼠粪便、刷牙后人类唾液、腋窝皮肤、地板瓷砖拭子和电脑键盘表面（即8种样本类型中的5种或63%），使用基质方法回收了更多的古菌和细菌物种，无论使用何种储存溶液。类似地，对于人类粪便、刷牙后唾液、腋窝皮肤、地板瓷砖拭子和电脑键盘表面（即8种样本类型中的5种或63%），使用基质方法回收了更多的真菌属，无论使用何种储存溶液。进一步跨所有样本类型，使用基质方法提取了更多的独有真菌属。鉴于这些发现，我们建议未来包含多种样本类型的研究，或旨在与其他数据集进行荟萃分析的研究，使用乙醇作为储存溶液，然后使用任一种提取方法，如果工作流程允许，优先考虑基质方法。类似地，未来专注于本文包含的单一样本类型的微生物组研究应考虑我们分别针对古菌+细菌物种和真菌属报告的分类单元偏差结果，并选择最优化方案。例如，我们观察到重要分类单元回收的可测量差异。

对于代谢物，异丙醇作为储存溶液在α多样性和分类单元偏差方面明显劣于乙醇，除了人类口腔样本。尽管先前的工作表明乙醇储存与甲醇（代谢组学提取中常用的溶剂）表现相似，但作者没有明确检查每个样本的α多样性。相反，Zuffa等人发现95%乙醇和50%甲醇在所有检查的粪便样本中回收了相似数量的分类单元。在这里，我们使用相同类型的分析表明，95%乙醇比95%异丙醇从除人类口腔样本之外的所有样本类型中回收了更多的独有代谢物以及更多的代谢物。这种模式在代谢物亚类层面也是一致的。我们注意到，尽管我们无法在这里将板式方法与基质方法进行代谢组学比较，但Zuffa等人之前的研究使用基质方法对乙醇与甲醇提取进行了基准测试，后者使用板式方法进行。此外，我们观察到板式方法中使用的木制拭子向储存溶液中贡献了不希望的化合物并吸收了不可忽视量的储存溶液，这使我们得出结论，基质方法适用于使用乙醇或甲醇进行代谢组学提取。

与我们的微生物组结果相反，虽然代谢物组成在高生物量样本类型的储存溶液之间一致，但我们观察到低生物量样本类型在乙醇和异丙醇储存的样本之间存在显著差异。这是预期的，因为各种代谢物在乙醇和异丙醇中的溶解度和稳定性不同，并且可以通过我们的代谢物偏差分析来解释。对于高生物量样本，乙醇在代谢物回收和重复样本间重叠方面表现略好。这强化了先前的发现，即乙醇是代谢组学的有效溶剂，同时也强调异丙醇应仅用于某些样本类型的储存。尽管异丙醇在某些偏远地区可能更容易获得，但在设计依赖一致代谢组学特征的研究时应考虑我们的结果。

总之，这些结果验证了基质方法作为传统板式工作流程的强大替代方案。通过实现从单一样本进行双组学提取、最小化劳动力并在不同条件下保持数据质量，基质方法解决了微生物组研究中的几个瓶颈。其与常温储存和自动化的兼容性使其非常适合旨在了解不同人群和环境中微生物组功能和动态的大规模、去中心化研究。

这项新方法也存在一些局限性值得进一步讨论。首先，我们研究中包含的每种样本类型的生物样本数量有限。这是我们基准测试新提取方法所固有的，它将高、低生物量样本的数量限制在单个96孔板（或一个基质管架）内，以避免评估板效应。与许多研究一样，增加每种样本类型的样本数量可能会影响结果。类似地，应探索其他样本类型。未来研究应探索基质方法在更大样本量集以及超出本文范围的样本类型中的成本/效益。

此外，尽管基质方法非常适应自动化、高通量样本处理，但它本质上是一种使用单管而非96孔板的提取方法。例如，Marotz等人比较了基于单管的提取方法与基于板式的方法，发现两种方法产生了可比的DNA产量、测序读数计数和微生物β多样性。然而，基于单管的方法需要比板式方法多2倍以上的处理时间。类似地，Minich等人在先前一项关注样本间污染的研究中比较了基于单管的提取与板式方法。他们报告说，单管方法导致的事件数量 drastically reduced compared to Plate-based Methods。除了使用的特定提取试剂盒外，那些其他研究中使用的板