TUBB1启动子甲基化：预测慢性乙型肝炎HBeAg血清学转换的新型生物标志物

本研究首次发现外周血单核细胞（PBMCs）中TUBB1基因启动子甲基化水平与慢性乙型肝炎（CHB）患者乙型肝炎e抗原（HBeAg）血清学转换（SC）显著相关。通过72周随访证实，基线TUBB1启动子低甲基化（PMR<14.80%）是HBeAg SC的独立预测因子（OR=0.683，P<0.001），其预测效能达AUC=0.805。该发现为CHB病程监测提供了新型无创表观遗传学标志物。

　　

ABSTRACT

乙型肝炎e抗原血清学转换（HBeAg SC）作为慢性乙型肝炎（CHB）治疗的重要里程碑，其预测指标的确立仍是临床挑战。本研究旨在探讨外周血单核细胞（PBMCs）中TUBB1启动子甲基化是否可预测HBeAg SC。共纳入271名参与者，包括145例HBeAg阳性CHB患者、94例HBeAg阴性患者及32名健康对照（HCs）。对HBeAg阳性患者进行72周随访，分别采用MethyLight和实时定量PCR检测PBMCs中TUBB1启动子甲基化及其mRNA水平。结果显示，HBeAg阳性患者TUBB1启动子甲基化水平显著高于HBeAg阴性组和HCs组，而TUBB1 mRNA表达则显著下调。甲基化水平在CHB四个自然史阶段呈现梯度下降趋势，发生HBeAg SC的患者基线甲基化水平更低。多因素分析证实TUBB1启动子甲基化是HBeAg SC的独立预测因子（OR=0.683，P<0.001），其预测AUC达0.805。本研究提示TUBB1启动子甲基化可作为预测HBeAg SC的潜在生物标志物。

IMPORTANCE

既往研究强调HBeAg SC与CHB疾病进展风险降低相关，但可靠的无创预测指标仍匮乏。本研究团队前期发现关键调控基因DNA甲基化与CHB进展相关，但TUBB1启动子甲基化与HBeAg SC的关联尚未明确。本研究首次证实HBeAg阳性患者TUBB1启动子呈现高甲基化状态，且甲基化水平降低与后续HBeAg SC独立相关，为CHB临床管理提供了新型表观遗传学工具。

INTRODUCTION

全球约2.96亿人慢性感染乙型肝炎病毒（HBV），2022年乙型肝炎导致约110万死亡。HBeAg阳性伴ALT持续升高者通常具有高HBV DNA载量，其肝硬化和肝癌风险显著增加。HBeAg SC（即HBeAg清除伴抗-HBe出现）是抗病毒治疗关键目标，早期实现SC提示疾病缓解与良好预后。目前亟需可靠无创标志物预测SC以指导临床。

DNA中CpG岛甲基化是哺乳动物基因组的常见表观遗传修饰，参与基因转录调控、肿瘤发生等过程。既往研究表明调控区域DNA甲基化可作为CHB进展的生物标志物。微管蛋白β1亚型（TUBB1）是细胞骨架关键组分，与血小板减少症、甲状腺发育异常等疾病相关。单细胞RNA测序发现PBMCs中TUBB1⁺单核细胞可能与CHB患者抗病毒活性降低相关，但TUBB1及其启动子甲基化在CHB自然史和HBeAg SC中的作用尚未阐明。

MATERIALS AND METHODS

研究设计

2012年1月至2023年6月于山东大学齐鲁医院纳入239例CHB患者和32名HCs。CHB患者均满足HBsAg阳性≥6个月，排除其他病毒共感染、合并肝病、恶性肿瘤及妊娠者。采集所有参与者基线PBMCs，提取DNA和RNA检测TUBB1启动子甲基化（PMR值）和mRNA表达（2^?ΔΔCt法）。对HBeAg阳性患者随访72周，通过标准试剂盒确认HBeAg SC。

实验方法

PBMCs通过Ficoll密度梯度离心分离，DNA提取后使用EZ DNA甲基化试剂盒进行亚硫酸氢盐修饰。MethyLight反应体系包含HotStarTaq Plus聚合酶、特异性引物探针（表1），以β-actin为内参，PMR计算公式为：100%×2^{?[ΔCt(样本目标基因?样本内参)?ΔCt(甲基化参照目标基因?参照内参)]}。RNA提取后逆转录为cDNA，采用TB Green预混液进行qPCR扩增。

统计分析

计量资料以中位数（四分位数）表示，分类资料以频数（百分比）表示。组间比较采用Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis H检验或卡方检验。相关性分析采用Spearman秩相关，HBeAg SC的独立影响因素通过二元Logistic回归分析。ROC曲线评估预测效能，以最大Youden指数确定最佳截断值。

RESULTS

研究人群特征

HBeAg阳性组较阴性组年龄更轻，ALT、AST、GGT、AFP水平更高，ALB水平更低。HBeAg阳性组HBV DNA检出率（77.24% vs 41.49%）及HBsAg水平（6,051.54 vs 1,858.60 IU/mL）均显著更高（均P<0.001）。TUBB1启动子甲基化水平在三组间差异显著（HCs:11.01%，HBeAg阴性:13.96%，HBeAg阳性:15.83%，P<0.001）。

甲基化与表达关联

TUBB1 mRNA表达在HBeAg阳性组显著低于阴性组和HCs组（P<0.01），而后两组无差异。Spearman相关分析显示启动子甲基化与mRNA表达呈负相关（r=?0.157，P=0.033）。

临床分期与相关性

按2017年EASL指南分期，TUBB1启动子甲基化水平在HBeAg阳性慢性感染（免疫耐受期）、HBeAg阳性慢性肝炎（免疫活化期）、HBeAg阴性慢性感染（非活动携带期）、HBeAg阴性慢性肝炎（再活动期）中依次递减。相关分析显示PMR值与HBeAg定量显著正相关（r=0.188，P=0.005），与其他临床指标无显著关联。

HBeAg SC预测价值

93例完成随访的HBeAg阳性患者中，28例（30.11%）实现SC。SC组基线TUBB1甲基化水平显著低于未转换组（13.60% vs 16.69%，P<0.001），且男性比例、ALT、AST水平更高。多因素分析显示PMR（OR=0.683）和ALT≥40 U/L（OR=4.951）是SC的独立预测因子。ROC曲线显示PMR预测SC的AUC为0.805（95%CI:0.704–0.907），最佳截断值14.80%对应的敏感度80.00%，特异度71.43%。在ALT升高亚组中预测AUC仍达0.773。

DISCUSSION

本研究首次揭示PBMCs中TUBB1启动子甲基化水平与CHB疾病分期相关，其高甲基化状态可能通过抑制TUBB1转录参与HBV免疫调控。虽然启动子甲基化与mRNA表达的负相关性较弱，但符合表观遗传调控的多因素特性。PBMCs作为免疫细胞集合体，其甲基化模式可反映肝脏免疫代谢紊乱的整体状态。研究局限性包括单中心设计、样本量有限及缺乏肝组织验证。未来需深入探讨TUBB1在HBV感染中的分子机制。

结论

TUBB1启动子甲基化可作为预测HBeAg SC的新型无创生物标志物，为CHB个体化治疗提供表观遗传学依据。