比较基因表达分析揭示次生代谢作为皮肤癣菌毒力驱动因素

本研究通过比较亲缘关系密切的皮肤癣菌（Trichophyton benhamiae复合群）的基因表达差异，发现次生代谢相关基因在离体（ex vivo）皮肤模型中显著上调，尤其在流行菌株T. benhamiae var. luteum中更为明显。研究采用RNA测序（RNA-seq）和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术，鉴定出两个生物合成基因簇（BGCs）——簇A（产生vioxanthin、xanthomegnin和viomellein）和未表征的簇B，提示次生代谢产物可能在皮肤癣菌毒力（virulence）和宿主适应中发挥关键作用。该发现为理解新兴真菌病原体的传播机制提供了新视角，并强调了改进基因组注释的重要性。

　　

ABSTRACT

皮肤癣菌是全球范围内影响人类和动物的重要真菌皮肤病原体。尽管通过基因组学、蛋白质组学和转录组学方法已经鉴定出几种毒力因子，但它们的作用仍未完全明了。本研究采用比较方法，利用Trichophyton benhamiae复合群内四个亲缘关系密切的分类单元，这些分类单元尽管共享共同宿主，但感染性不同。我们重点关注新兴的人畜共患病原体T. benhamiae var. luteum（目前在欧洲引起流行病爆发），并将其与感染性较弱的近缘种进行比较。通过初步转录组筛选，筛选出16个候选基因，并通过RT-qPCR在12个菌株（在体外萨布罗右旋糖酐肉汤和离体小鼠皮肤外植体中培养）中进行了评估。与次生代谢相关的基因在离体条件下持续上调，尤其是在T. benhamiae var. luteum中。虽然所检查的两个生物合成基因簇与已知代谢物相关，但其他簇仍未表征。这些发现揭示了可能解释新兴菌株感染性增强的关键基因表达差异，并强调了次生代谢物在皮肤癣菌毒力中的潜在作用。它们也凸显了改进T. benhamiae基因组注释以更好地理解发病分子机制的必要性。

INTRODUCTION

皮肤癣菌是广泛存在的真菌病原体，在全球人类中的患病率为20%–25%。近几十年来，由于抗真菌耐药菌株的增加和新物种的发现，对这些真菌的认识有所提高。一个主要的公共卫生问题是Trichophyton benhamiae var. luteum（在欧洲通常称为T. benhamiae的“黄色表型菌株”）的快速传播。这种新兴的人畜共患病原体已在欧洲豚鼠农场、宠物店及其主人和儿童（尤其是年轻人）中广泛传播。有趣的是，近缘物种T. japonicum和T. europaeum（通常称为“白色表型菌株”）在欧洲同一宿主上存在了几十年，但并未引发类似的爆发和流行。尽管有豚鼠同时感染T. benhamiae var. luteum和“白色表型菌株”（即T. europaeum和T. japonicum）的记录，但T. benhamiae var. luteum的流行菌株导致人类感染的频率比其近缘种高30倍，在豚鼠中高4倍。与T. benhamiae var. luteum相比，T. japonicum和T. europaeum在豚鼠和人群中的发病率较低，可能是因为它们的感染性较低。此外，属于与流行菌株相同物种的不同变种（T. benhamiae var. benhamiae）的种群存在于北美，但该地区尚未有这些菌株引起流行的报道。与近缘种甚至同一物种的其他种群相比，为什么流行菌株在欧洲豚鼠和儿童中传播如此有效，目前尚不清楚。

皮肤癣菌已经发展了在宿主体内传播和入侵组织的各种机制。一个关键特征是其通过分泌蛋白酶降解角蛋白和其他皮肤成分的复杂机制。著名的例子包括枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶、二肽基肽酶、亮氨酸氨基肽酶和金属肽酶。宿主通过几种防御机制来对抗皮肤癣菌感染，例如高体温、皮肤的弱酸性pH值，以及先天免疫（如角质形成细胞、巨噬细胞、中性粒细胞）和适应性免疫（尤其是Th1和Th17细胞介导的应答）。皮肤癣菌可以逃避一些宿主屏障，并产生多种蛋白酶，这些蛋白酶根据环境pH值而变化。由于皮肤癣菌降解角蛋白，周围区域的pH值升高，从而损害宿主的天然免疫力。皮肤癣菌产生的化合物，如青霉素G、黑色素、xanthomegnin和vioxanthin，是已知或可疑的毒素和/或免疫调节剂。然而，次生代谢物在皮肤癣菌发病机制中的作用仍未得到充分探索。

尽管皮肤癣菌之间具有高度的遗传相似性，但不同物种表现出不同的宿主偏好和在不同宿主物种中不同程度的毒力。这些差异可能源于基因表达和酶活性调节的变异。有几种方法可用于识别潜在的毒力因子。在皮肤癣菌中，比较研究主要集中于体外腐生生长和体内寄生生长阶段的基因表达。除了传统的体外模型外，还开发了几种离体皮肤模型，以更好地模拟皮肤癣菌的真实感染条件。这些包括重建人表皮和基于类器官的模型，它们提供了人体组织的相关性，但可能缺乏完整的皮肤结构、免疫成分或机械屏障完整性。相比之下，动物来源的外植体保留了天然皮肤结构，并允许在接近生理条件下进行短期真菌定植。另一种选择是比较感染性或毒力不同的相关物种。然而，这需要使用非常近缘的种群或物种，以确保观察到的结果不能简单地归因于物种在 speciation 过程中的差异。这种比较方法尚未用于皮肤癣菌。

在本研究中，我们应用比较基因表达方法来识别皮肤癣菌中候选的毒力相关基因。我们比较了感染性较强的分类单元与感染性较弱但亲缘关系密切的分类单元，以识别可能与毒力相关的基因表达差异。这种方法使我们能够区分跨分类单元共享的一般毒力因子和可能与增强的感染性相关的毒力因子。候选基因基于初步转录组数据和文献证据进行选择，然后通过RT-qPCR在更广泛的菌株数据集中验证其表达，以加强观察到的模式的稳健性。

MATERIALS AND METHODS

菌株和培养条件

总共使用了12个菌株——来自四个亲缘关系密切的分类单元（T. benhamiae var. benhamiae, T. benhamiae var. luteum, T. japonicum, 和 T. europaeum）各3个。所有菌株均可从查尔斯大学真菌菌种保藏中心公开获得。物种鉴定通过ITS rDNA测序确认。菌株在麦芽提取物琼脂上于6°C黑暗条件下保存。实验前，所有菌株进行传代培养以确保纯度。为了最大限度地降低污染风险，通过将稀释的接种物涂布在MEA平板上并选择单个形态典型的菌落进行进一步使用，进行了单菌落分离步骤。菌株还在补充了氯霉素的液体培养基中短暂培养，并通过显微镜检查排除了细菌污染。

为了制备接种物，将菌株在萨布罗右旋糖酐肉汤中于30°C、200 rpm振荡培养8天。将得到的生物量通过涡旋振荡均质化并稀释以获得大致相等的细胞密度。使用这种方法代替标准孢子悬浮液，因为一些菌株——尤其是T. benhamiae var. luteum——是不育的。

为每个菌株和两种培养条件（液体培养和离体皮肤模型）制备了3到5个生物学重复。液体培养通过将30 mL SDB接种4 μL均质物并在上述相同条件下孵育来启动。

小鼠皮肤模型

离体小鼠皮肤外植体模型方案基于已发表的方法进行开发和优化。从CAS微生物研究所的繁殖设施获得健康的三个月大雄性BALB/c小鼠。所有涉及动物的程序均完全遵守捷克立法和《实验室动物护理和使用指南》。

使用电动剪毛机修剪活小鼠的背部毛发，随后对动物实施安乐死。修剪区域用70%乙醇擦拭。在无菌条件下切除皮肤部分（2 × 2 cm），清除脂肪组织，并放入0.1%苯扎溴铵溶液中消毒。

30分钟内，用冰镇磷酸盐缓冲盐水清洗样品，在1%青霉素-链霉素中浸泡10分钟，然后用PBS和Pen-Strep再清洗两次。最后，将皮肤样品放在6孔板中的无菌纱布上。

每个样品接收1 mL小鼠皮肤液，其组成包括10%热灭活胎牛血清、8% MSF缓冲液和1% Pen-Strep。MSF缓冲液（调节至pH 6.4）包含：8.0 g/l NaCl, 0.4 g/l KCl, 0.0875 g/l Na₂HPO₄, 0.0625 g/l KH₂PO₄, 0.2 g/l MgSO₄, 和 6.25 g/l D-葡萄糖。

将4 μL经显微镜确认无细菌污染的SDB培养上清液添加到每个皮肤样品中。样品在30°C和5% CO₂条件下不振荡孵育8天。每天更换MSF。基于初步RNAseq分析选择8天的培养期。

RNA提取和处理

通过以1000 rpm离心10分钟收获液体培养物中的菌丝体。将菌丝体或定植的皮肤在液氮中研磨，重悬于1 mL TRIzol试剂中，并在–35°C下保存直至RNA分离。按照制造商的说明提取RNA。使用等量的总RNA进行下游cDNA合成，但离体样品中的真菌生物量未与宿主组织分开定量。

使用NanoDrop 1000分光光度计评估RNA浓度和纯度。使用TURBO DNA-free Kit去除基因组DNA，并使用RNaseOUT重组核糖核酸酶抑制剂进行保护。通过用溴化乙锭染色的1%琼脂糖凝胶电泳确认RNA完整性。使用Qubit RNA HS和BR测定试剂盒在Qubit 2.0荧光计上测量浓度。

通过RNA测序鉴定候选基因

为了识别可能参与毒力和宿主相互作用的基因，对两个代表性菌株——T. benhamiae var. luteum (IHEM 25742) 和 T. japonicum (NUBS 13002)——在体外和离体条件下进行了RNA-seq。

使用Agilent 2100 Bioanalyzer和RNA 6000 Nano Kit进一步验证RNA质量。由于RNA中度降解（RIN <8），相应调整了文库制备。

使用NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module去除核糖体RNA，并使用KAPA RNA HyperPrep Kit制备文库。使用20 ng RNA作为输入；在85°C下片段化2分钟，然后进行14个扩增循环。使用索引适配器，在Illumina NextSeq 500平台上进行测序。

使用STAR v.2.7.1比对读数，并使用Bowtie2映射到基于T. europaeum菌株CBS 112371的基因组索引。使用R v.3.6.0中的DESeq2包进行差异表达分析，计算标准误差和log₂倍数变化。应用Wald检验和Benjamini-Hochberg校正。使用来自两种条件的所有重复。调整后P值 < 0.05的基因被认为是显著的，并使用NCBI和UniProt数据库进行注释。

RT-qPCR分析

对于RT-qPCR，使用LunaScript RT SuperMix Kit按照制造商的方案将1 μg总RNA反转录。在qPCR之前，将来自三个高质量生物学重复的cDNA等量混合。选择这种方法是为了最大限度地减少个体水平变异带来的噪音，并确保在大量靶基因和条件下有足够的cDNA量。我们承认混合限制了评估菌株内变异性的能力。

使用CFX96实时系统和Luna Universal qPCR Master Mix进行定量PCR。PCR反应使用0.5 μL 10 pM引物和0.5 μL cDNA，最终体积为20 μL。反应包括在95°C初始变性60秒，随后进行39个循环的95°C 15秒和60°C 30秒，在95°C失活60秒，在54°C冷却60秒，最后在25°C冷却60秒。通过以0.5°C增量每10秒从54°C升温至95°C进行熔解曲线分析。每个测量重复进行两次，如果标准偏差超过2，则重复实验。

引物设计和效率测试

ARB_00701和TERG_04919的引物对改编自先前发表的研究。所有其他引物均使用Primer-BLAST基于T. europaeum CBS 112371的基因组序列进行设计。每个引物对的设计使得至少一条引物跨越外显子-外显子连接处，以避免基因组DNA的扩增。

使用OligoAnalyzer工具评估潜在的二级结构，接受的引物显示二聚体ΔG > –7 J，发夹ΔG > –4 J。使用混合cDNA和系列稀释测试所有引物对。引物效率在85%到100%之间。

RT-qPCR数据处理和分析

使用RefFinder分析了四个先前发表的参考基因的稳定性和可靠性，该工具集成了BestKeeper、NormFinder和geNorm工具。具体分析的基因是ARB_06116 (DNA-directed RNA polymerase II subunit RPB2; rpb2), ARB_03667 (ADP-ribosylation factor; adp-rf), ARB_00512 (Mitotic cohesin complex subunit Psm1; psm1), 和 TERG_04919 (Chitin synthase; CHS)。基于此分析，选择rpb2和adp-rf作为最稳定的参考基因。

使用软件Bio-Rad CFX Manager v. 3.1处理获得的RT-qPCR数据。由于检查的基因数量众多，并且无法在单个板上测量两种条件下所有基因的表达，因此选择效率加权方法进行数据标准化。出于相同原因，两个参考基因始终在每个板上为所有测量的样品运行，作为板间校准品。进行了2^-ΔΔCt分析。由于使用了技术重复，并且cDNA在qPCR之前进行了混合，统计比较反映了菌株间的变异而非菌株内的变异性。提供了每个菌株在不同培养条件下的循环阈值范围、反应效率、决定系数、相对基因表达（ΔCt）值以及个体基因的效应大小测量值（2^-ΔΔCt）。使用Shapiro-Wilk检验测试数据的正态分布。基于结果，进行ANOVA或Kruskal-Wallis检验，然后进行成对t检验。

对于统计分析，使用R v. 4.2.1及其相关包。使用Tidyverse中的包，特别是ggplot2，以及其他包进行数据可视化。

生物信息学鉴定生物合成基因簇

使用antiSMASH v.7.1.0的真菌版本鉴定了T. benhamiae基因组中的生物合成基因簇。为了评估感兴趣基因或簇的相似性水平，使用了Ident and Sim工具、BLAST v. 2.15.0和MAFFT。使用R v. 4.2.1中的gggenes包进行簇的可视化。

组织学分析

在RNA提取之前，将选定的皮肤样品的5 × 5 mm部分进行固定、包埋和染色。在4%多聚甲醛和10%福尔马林中固定48小时。使用Leica ASP200s脱水，并使用Leica EG110系统包埋在石蜡中。

使用Leica RM2125 RTS旋转切片机切割切片（3 μm）并置于预涂层的载玻片上。使用标准苏木精和伊红染色方案进行染色，并附加苯清除步骤。将样品封固在加拿大香脂中，盖上玻璃盖玻片，并硬化过夜。H&E染色切片用于定性确认真菌入侵和组织定植。未进行定量真菌负荷测量（例如通过ITS拷贝数或CFU计数）。

RESULTS

靶基因的选择

在T. benhamiae var. luteum IHEM 25742和T. japonicum NUBS 13002之间，总共有85个基因存在显著差异表达（调整后P < 0.05）。超过一半的推定功能是从预测的蛋白质结构推断的。根据antiSMASH分析，11个基因属于两个生物合成基因簇。一个簇被鉴定为vioxanthin、xanthomegnin和viomellein BGC，此处称为簇A；第二个功能未知，称为簇B。此外，在数据集中还识别出另外两个基因（ARB_04645, ARB_07966）。ARB_04645是关节菌科中先前描述的麦角碱生物合成途径的一个组成部分。与ARB_07966相关的簇无法识别。其他差异表达基因与跨膜转运、基本细胞功能、细胞壁重塑和硫代谢相关。

基于这些数据，选择了代表不同细胞功能的16个基因，通过RT-qPCR在来自T. benhamiae复合群的12个菌株的更大数据集上进行了进一步研究。从转录组数据集中选择了9个基因——其中7个显示出显著的菌株间差异，5个与BGCs相关。尽管p值不显著，但由于其假定的功能相关性，另外两个基因（ARB_02741和ARB_05770）也被纳入。另外七个基因是根据文献综述作为已知的皮肤癣菌毒力因子选择的。

选定基因的功能注释

生物信息学分析显示，簇A中的六个基因（ARB_07989–ARB_07994）与来自T. rubrum的含漆酶的vioxanthin、xanthomegnin和viomellein BGC具有高度相似性。簇B中的五个基因无法与任何已知代谢物联系起来。核心基因（ARB_07534）被注释为LovB样聚酮合酶或由nscA编码的非还原性聚酮合酶。然而，与来自A. terreus的洛伐他汀合酶LovB的蛋白质水平同一性仅为21%，与来自T. tonsurans的新萨托里辛合酶NscA的同一性为17.64%。基于这种低序列相似性，ARB_07534不太可能执行与这些酶相同的生物合成功能。

RT-qPCR分析

体外和离体条件下的基因表达

在两种培养系统中，样品聚类反映了物种水平的差异，除了少数情况：体外条件下T. benhamiae var. benhamiae与var. luteum的比较，以及离体条件下T. japonicum的情况。在离体模型中，物种分离更清晰，甚至两个亲缘关系密切的T. benhamiae变种也明显分组。

基因表达在离体条件下普遍较高，但只有三个基因显示出统计学显著差异。蛋白酶基因DPPIV (ARB_06110)在T. benhamiae var. benhamiae和T. japonicum之间表达显著不同。与T. japonicum相比，T. europaeum显著过表达聚酮合酶ARB_07994（簇A）。此外，III类几丁质酶chiA2 (ARB_03514)在T. benhamiae var. luteum中的表达显著低于其他分类单元。

有趣的是，几个基因在几乎所有T. benhamiae复合群菌株的离体条件下持续上调。值得注意的是，SUB3 (ARB_00701)变化高达七倍，LAP2 (ARB_00494)变化高达五倍，III类几丁质酶chiA2 (ARB_03514)变化高达四倍，细胞色素P450单加氧酶 (ARB_07818)变化高达三倍，过氧化氢酶easC (ARB_04645)变化高达五倍。

体外条件下的差异表达

在体外条件下，观察到基因表达的适度差异，主要在与碳水化合物代谢和细胞壁重塑相关的基因中。这些基因包括乙醛酸循环的酶——苹果酸合酶 (ARB_07638) 和异柠檬酸裂解酶 (ARB_07814)，以及细胞壁合成相关酶1,3-β-葡聚糖糖基转移酶 (ARB_05770) 和III类几丁质酶chiA2 (ARB_03514)。在所有情况下，T. benhamiae var. benhamiae与其他分类单元形成不同的簇。此外，T. japonicum显示出簇A的聚酮合酶ARB_07994的独特表达。

离体条件下的差异表达

在离体条件下的MSE上，观察到分类单元之间明显的表达谱，尤其是参与次生代谢的基因。T. benhamiae var. luteum的流行菌株显示出Fasciclin结构域蛋白 (ARB_07991, 簇A) 和聚酮合酶ARB_07534 (簇B) 的差异表达。此外，与其他分类单元相比，T. europaeum的1,3-β-葡聚糖糖基转移酶 (ARB_05770) 表达显著较低。

离体皮肤模型的评估

为了评估菌株在离体模型中的定植性能，对皮肤样品进行了组织学分析。显微镜检查显示广泛的真菌定植和角质层破坏。值得注意的是，T. benhamiae var. luteum在皮肤组织中产生了小分生孢子，尽管在琼脂培养基上孢子形成有限。

DISCUSSION

在本研究中，我们使用了Trichophyton benhamiae复合群内四个亲缘关系密切的分类单元的比较模型。通过检查这些亲缘关系密切的分类单元之间的差异，我们旨在识别影响它们在宿主群体中适应和传播能力变化的因素。类似的比较转录组方法已应用于其他真菌病原体以揭示毒力相关性状。然而，关于皮肤癣菌的研究主要集中于系统发育上遥远物种之间的比较。在我们的模型中使用亲缘关系密切的分类单元使我们能够检测到基因调控和适应中微妙但具有生物学意义的差异。

本研究的一个关键发现是次生代谢相关基因的上调，尤其是在流行分类单元T. benhamiae var. luteum中。在识别的候选基因中，有几个显示出一致的差异表达，其中大多数属于两个生物合成基因簇：簇A，包括vioxanthin、xanthomegnin和viomellein生物合成基因（由基因ARB_07994和ARB_07991代表），和簇B，一个未表征的簇（由基因ARB_07534代表），没有紧密同源物。这些基于多个菌株的RT-qPCR分析的结果表明，次生代谢物的产生可能有助于皮肤癣菌的毒力和宿主适应。

差异表达模式不仅限于这些簇。参与chanoclavine I生物合成（麦角碱途径的关键前体）的过氧化氢酶easC基因 (ARB_04645) 在菌株间的表达也显示出显著变异，表明次生代谢的菌株特异性调节。类似地，来自簇A的聚酮合酶 (ARB_07994) 在离体条件下在T. japonicum中显著低表达，表明聚酮生物合成受到环境调节的控制。

皮肤癣菌基因组编码的BGCs比其他致病真菌更多，但很少有功能表征。它们的一些已知产物——如vioxanthin、xanthomegnin和neosartoricin B——已知具有细胞毒性或免疫调节作用。先前的工作表明，皮肤癣菌中的次生代谢物谱与系统发育相关，表明次生代谢受到强大的进化压力。同一研究确定了由T. benhamiae复合群成员产生的一组独特的次生代谢物，特别是含硫化合物。我们的转录组数据进一步支持了这一观点，特别是在硫相关代谢方面，多个基因显示出分类单元特异性表达。这些发现表明，次生代谢可能塑造T. benhamiae复合群中的生态适应和宿主-病原体相互作用。

除了次生代谢，我们还评估了编码分泌蛋白酶的基因的表达，这些是皮肤癣菌中已知的毒力因子。与早期的发现一致，基因如SUB3 (ARB_00701)、DPPIV (ARB_06110)、DPPV (ARB_06651) 和LAP2 (ARB_00494) 在离体条件下上调。然而，它们的表达在不同分类单元之间基本一致，除了DPPIV显示出一些变异。这表明分泌蛋白酶可能是核心毒力决定因素，但不是密切相关的分类单元之间毒力变异的区分标志。

我们还观察到参与碳水化合物和脂肪酸代谢的基因，如异柠檬酸裂解酶 (ARB_07814)，在离体条件下上调。这些基因可能反映了对宿主来源底物（如角蛋白和脂质）的适应，这些底物在合成培养基中不存在。

离体条件下的基因表达差异比体外更显著，加强了模型的生物学相关性。离体培养的菌株按分类单元聚类，可能反映了在模拟宿主条件下更强的选择压力。这强调了皮肤癣菌在复杂环境中的适应性，其中代谢灵活性对于生存至关重要。这些转录反应可能反映了皮肤组织内的宿主-真菌相互作用，我们只能使用组织学染色进行基本水平的评估。虽然H&E染色证实了真菌入侵皮肤组织，但它不能提供细胞或超微结构水平上真菌-宿主相互作用的详细分辨率。未来的研究可以受益于使用互补的成像方法，如荧光或电子显微镜，以更好地表征定植的空间动力学。尽管离体模型受到缺乏主动免疫反应和使用小鼠而非人体组织的限制，但它有效地概括了差异基因表达，并为评估真菌适应提供了模拟宿主的背景。相比之下，体外条件下的基因表达模式在不同分类单元之间高度相似，表明物种特异性反应仅由离体条件下存在的环境因素触发，例如皮肤及其衍生物的结构复杂性。

观察到菌株ME 192/12与预期聚类模式的偏差，尽管其遗传上归属于T. europaeum，但与T. japonicum分组。这可能反映了分类学的模糊性或这些亲缘关系密切的物种之间的基因流动。此外，细胞壁重塑基因的表达，包括chiA2 (ARB_03514) 和1,3-β-葡聚糖糖基转移酶 (ARB_05770)，显示出分类单元特异性差异。这些酶在真菌细胞壁重构中起关键作用，可能有助于生长形态和环境适应的差异。

我们的研究提供了对T. benhamiae复合群内潜在毒力因子的新见解。虽然分泌蛋白酶传统上被视为毒力的主要贡献者，但它们的表达在不同分类单元之间变化很小。相比之下，次生代谢基因显示出显著的差异表达，尤其是在离体条件下，强调了次生代谢物在皮肤癣菌适应性和致病性中的潜在作用。这些真菌产生独特化合物（包括含硫代谢物）的能力表明，次生代谢途径不仅受到强大进化压力的塑造，而且可能对宿主适应和生存至关重要。

虽然我们的数据显示候选基因的一致差异表达，但我们承认离体条件下基因表达的变异可能部分反映了菌株间真菌生物量的差异。然而，流行分类单元T. benhamiae var. luteum显示出几个基因的最高表达，已知其生长速度比测试的其他分类单元慢。因此，它在离体模型中可能产生最低的真菌生物量。这支持了观察到的过表达反映了真正的上调而非生物量驱动效应的解释。此外，使用两个经过验证的、稳定表达的家务基因（rpb2和adp-rf）作为内部对照进行标准化，有助于减少可变真菌载量带来的偏差。尽管如此，未来结合定量真菌负荷测量的研究将有助于区分生物量效应和转录调控。

未来的工作应侧重于功能验证基因如ARB_07534，以及更广泛的比较研究，以更好地表征皮肤癣菌的生物合成能力。这可能包括基于LC-MS的次生代谢物代谢组学分析或靶向基因破坏（例如CRISPR-Cas9敲除ARB_07534）以确认其在毒力和适应中的作用。此类研究对于推进靶向诊断、抗真菌策略以及我们对皮肤癣菌发病机制的理解至关重要。

ACKNOWLEDGMENTS

该项目得到了捷克科学院长期研究发展项目和支持。我们还感谢来自项目和其他个人的宝贵帮助。本研究报告是ISHAM Onygenales工作组长期目标的一部分。