美国密歇根州柳树乔木保护区柳枝稷根际及土壤中伯克霍尔德氏菌与副伯克霍尔德氏菌基因组草图解析及其促生潜力研究

本研究由来自美国密歇根州的研究团队开展，聚焦于生物燃料作物柳枝稷（Panicum virgatum）的根际微生物组。研究人员成功分离并测定了两株Paraburkholderia和两株Burkholderia的基因组草图，揭示了其与植物互作的遗传基础，为利用有益微生物促进柳枝稷生长、提升生物燃料可持续生产提供了关键的基因资源。

　　

研究人员公布了从美国密歇根州柳树乔木保护区（Lux Arbor Reserve）的柳枝稷（Panicum virgatum）土壤和根部分离得到的两种副伯克霍尔德氏菌（Paraburkholderia）和两种伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）菌株的基因组草图。其中三株菌分离自根围土壤，一株分离自柳枝稷根部。

理解与柳枝稷（一种专用生物燃料作物）相关的微生物，对于提高生物燃料生产的可持续性至关重要。用于分离的根和土壤样本采集自边际土地试验（Marginal Lands Experiment）柳树乔木保护区站点（42.4764, -85.4519）的柳枝稷单一种植小区（G5处理）。该试验站于2015年建立，是美国大湖生物能源研究中心的一部分。该站点设有四个重复区块，每个区块包含一个柳枝稷小区，每个小区内又包含施氮（56 kg/ha/年）和不施氮的子小区。站点土壤为典型弱发育半干淋溶土（Alfisol），质地为壤土，pH值为5.8，总碳含量0.77%，总氮含量0.06%，无机磷含量为12 ppm。

副伯克霍尔德氏菌 aspalathi（Paraburkholderia aspalathi）DN3004、禾本科副伯克霍尔德氏菌（Paraburkholderia graminis）DN3005和伯克霍尔德氏菌 sp.（Burkholderia sp.）DN3021分离自未施肥小区柳枝稷植株附近采集的含有根物质的10厘米土壤芯。多变伯克霍尔德氏菌（Burkholderia ambifaria）DN3045则分离自施肥小区采集的柳枝稷根部。

用于分离的土壤悬浮并稀释于0.9% NaCl缓冲液中。菌株DN3004和DN3005在含有蔗糖（20 g/L）的伯克氏培养基（Burk’s Medium）上分离得到。DN3021在2%氧气环境下的伯克氏蔗糖培养基中分离。对于DN3045的分离，将一英寸长的根段用漂白剂表面灭菌，无菌水冲洗，然后插入伯克氏软琼脂（含甘露醇）中。分离方案参考文献方法。分离物在30°C下培养。从-80°C冷冻库存复苏后，在含有蔗糖和0.5 g/L NH₄Cl的伯克氏琼脂平板上划线，于30°C培养，每24小时检查直至生长明显，挑取单菌落在相同条件下培养，使用DNeasy PowerLyzer Microbial Kit（Qiagen, Germantown, MD, USA）从琼脂培养的菌落中提取基因组DNA。使用Sera-Mag Speedbeads羧化磁珠（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）纯化DNA，并用Tris缓冲液洗脱。文库构建和全基因组测序在SeqCenter（Pittsburgh, PA）完成。使用Illumina DNA Prep kit和IDT 10 bp UDI indices制备DNA文库，并在Illumina NextSeq 2000上进行测序，产生2 × 151 bp读长。使用bcl2fastq（v2.17; Illumina）进行数据拆分、质量控制和接头修剪。使用Shovill（v. 1.1.0）内的Spades v3.14.1进行组装，参数如下：基因组大小7.5 Mb；最小重叠群长度500 bp，“--trim”，最小覆盖度20×。使用QUAST v5.2.0计算基因组统计信息。使用CheckM v1.2.3评估基因组的完整度和污染情况。使用NCBI原核基因组注释管道（PGAP）v6.10对基因组进行注释。为了进行物种鉴定，使用Type Strain Genome Server（TYGS）v391获取与模式菌株的数字DNA-DNA杂交（dDDH）值。在PhyloPhlAn v3.0.67中，使用Diamond v2.1.8对细菌中普遍保守的400个氨基酸标记序列数据库进行搜索，参数为“--diversity medium”和“--accurate”，比对对象包括四个新测序菌株的蛋白质组以及从NCBI下载的12个伯克霍尔德氏菌和副伯克霍尔德氏菌参考基因组。使用Mafft v7.520比对标记基因，使用trimAl “--gappyout”进行修剪，并连接起来用于系统发育重建，使用RAxML v8.2.12在“PROTCATLG”模型下进行最大似然法分析，并进行1000次快速自举检验。除非另有说明，所有工具均使用默认参数。详细的基因组信息和登录号见表1。这些基因组可能有助于扩展我们对与柳枝稷相关的潜在植物促生细菌的认识。

图1显示了基于伯克霍尔德氏菌和副伯克霍尔德氏菌菌株（从柳枝稷中分离的菌株以粗体标示）及其相关参考基因组的保守标记基因序列串联构建的系统发育树，该树通过RAxML v8.2.12的最大似然法推断。树在中点重新定根。自举值显示在节点处。比例尺表示每位点的氨基酸替换数。

表1提供了伯克霍尔德氏菌 sp. DN3021、多变伯克霍尔德氏菌 DN3045、副伯克霍尔德氏菌 aspalathi DN3004和禾本科副伯克霍尔德氏菌 DN3005的基因组组装统计信息，包括菌株、分类学命名、TYGS dDDH值、读长数量、基因组大小、重叠群数量、GC含量、N50、L50、中位数、完整度、污染率、覆盖度、编码序列总数、RNA数量、tRNA数量以及GenBank、组装和SRA登录号等。

本研究获得了美国能源部科学办公室生物与环境研究司通过大湖生物能源研究中心（奖项DE-SC0018409和DE-FC02-07ER64494）和MMPRNT（DE-SC0014108）的支持。MLF还获得了美国农业部国家食品与农业研究所的Hatch项目1014527的支持。我们承认该试验站点位于Anishinaabeg祖先的、传统的和当代的土地上，这些土地在1819年的萨吉诺条约中被割让。

作者贡献如下：Hanna Kehlet-Delgado负责形式分析、方法论、调查、数据整理、初稿撰写、审阅编辑；Renee H. Petipas负责概念化、方法论、调查、验证、数据整理、形式分析、初稿撰写、审阅编辑；Amanda A. Antoch负责概念化、方法论、调查、验证、审阅编辑；Jeffrey S. Norman负责调查、方法论、概念化、审阅编辑；Xiufen Li负责方法论、审阅编辑；Richard Allen White III负责方法论、审阅编辑；Sarah E. Evans负责项目管理、审阅编辑、资源、监督、资金获取；Lisa K. Tiemann负责项目管理、审阅编辑、资源、监督、资金获取；Maren L. Friesen负责项目管理、审阅编辑、资源、监督、资金获取。