猪肌内前脂肪细胞永生化模型的建立及其在脂质代谢与内质网应激研究中的应用

本研究针对肌内脂肪组织与代谢综合征风险增加的相关性，建立了永生化猪肌内前脂肪细胞模型，解决了原代细胞快速衰老导致分化能力受限的问题。研究人员通过转染HPV16-E6/E7和hTERT基因成功构建细胞系，证实其具备长期增殖和稳健分化能力（>24代）。研究发现内质网（ER）应激可负向调节成脂标志物，并揭示了CREB3、ATF6等ER/Golgi应激相关因子在脂质代谢中的调控作用。该模型为研究人类代谢疾病机制提供了更接近生理的猪源平台，对阐明ER应激在脂肪生成中的分子通路具有重要意义。

　　

随着全球Ⅱ型糖尿病（T2D）患病率的持续攀升，探索影响此类健康风险发生机制的模型显得尤为重要。肌内脂质积累已被证实与胰岛素抵抗、代谢综合征及T2D的发展密切相关。与内脏脂肪等研究较为深入的脂肪库相比，肌内脂肪组织作为关联代谢健康的关键 depot（储存库）却研究不足。传统研究多依赖于小鼠3T3-L1细胞模型，但其源于胚胎细胞而非特定脂肪库，且猪基因组与人类更接近，生理特性更具相关性，因此开发猪源细胞模型对人类健康研究具有独特价值。

原代前脂肪细胞在体外培养时面临快速衰老的困境，通常传代不超过6次即丧失分化能力，这严重限制了其在机制研究中的应用。为突破此瓶颈，研究人员尝试通过表达病毒癌基因实现细胞永生化。然而常用猿猴病毒40大T抗原（SV40-Tag）会干扰CBP/p300转录复合体——该复合体是成脂分化所必需的关键调控因子。因此，开发不干扰成脂通路的新型永生化策略成为领域内亟待解决的问题。

在此背景下，本研究旨在建立一种新型永生化猪肌内前脂肪细胞系，并利用该模型探讨内质网（ER）和高尔基体（Golgi）应激对脂肪生成的影响。特别关注一个新兴的应激相关蛋白——CREB3，该蛋白是一种ER锚定转录因子，近期研究表明其与脂质稳态调控存在关联。研究论文发表于《Biochemistry and Cell Biology》期刊。

为开展本研究，研究人员运用了几个关键技术方法：从3日龄约克夏×长白猪的背最长肌组织中分离原代肌内前脂肪细胞；通过核转染技术共转染人乳头瘤病毒16型E6/E7（HPV16-E6/E7）基因和人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因进行细胞永生化；采用含地塞米松（DEX）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、胰岛素（INS）和罗格列酮（ROS）的DMI培养基诱导细胞成脂分化；使用布雷菲德菌素A（BFA）作为ER/Golgi应激诱导剂；通过油红O染色和甘油三酯含量测定评估脂质积累；运用液滴数字PCR（ddPCR）、定量实时PCR（qRT-PCR）和蛋白质印迹（Western blot）技术分析基因和蛋白表达水平。

永生化肌内前脂肪细胞模型在长期传代后保持分化潜能

研究人员从猪背最长肌成功分离出前脂肪细胞，并通过导入HPV16-E6/E7及hTERT基因实现了细胞的稳定永生化。该细胞系可连续传代超过24次而未出现复制阻滞或衰老迹象。qRT-PCR检测证实HPV16 E7基因在不同传代（<10、10-20、>20）的细胞中持续稳定表达，标志着永生化成功。形态学观察显示，经DMI培养基诱导分化14天后，细胞出现明显的脂滴，油红O染色呈阳性反应，且这种成脂能力在传代至24代以后依然保持。定量分析表明，诱导分化细胞的甘油三酯含量显著高于未诱导细胞。对成脂标志基因FABP4的表达分析进一步支持了该细胞模型具有稳健且持久的分化能力。

诱导分化后脂质代谢和应激反应靶点的差异表达

通过ddPCR和qRT-PCR对一系列参与脂质代谢和ER应激反应的基因进行探索性分析。结果显示，在分化细胞中，与脂肪酸氧化、线粒体生物合成相关的基因（如PPARGC1A、LPL、SCD）表达上调。相反，与ER应激反应（ATF6、CREB3）及高尔基体运输（ARF4）相关的基因表达则下调。值得注意的是，糖皮质激素受体基因NR3C1的表达也显著降低。蛋白质水平分析证实，PGC-1α和CREB3的蛋白表达变化与其基因表达趋势一致。这些结果表明，脂肪生成过程伴随着脂质代谢通路的激活以及ER/高尔基体相关应激反应的抑制。

ER/高尔基体应激剂布雷菲德菌素A处理改变成脂和应激相关标志物的表达

为探究ER/高尔基体应激对脂肪生成的影响，研究使用BFA处理细胞。发现在分化第7天（D7）施加BFA应激24小时后，成脂标志物FABP4的表达呈现下降趋势。同时，BFA处理显著诱导了应激反应基因ATF6和CREB3的表达，尤其在DMI诱导的细胞中这种诱导效应更为明显。ARF4和NR3C1基因在BFA处理的D7细胞中也出现表达上调。Western blot分析显示，BFA处理条件下出现了CREB3的活化形式——N末端（NT）片段，表明CREB3被成功激活并可能发挥转录调控功能。这些发现提示ER/Golgi应激能够影响成脂过程，并激活相关的应激应答通路。

布雷菲德菌素A对分化诱导的成脂和应激相关标志物表达无显著影响

进一步分析比较了在分化进程中（非诱导NI vs. 诱导7天D7）BFA应激的影响。当将D7诱导样本与其对应应激处理组的NI样本进行比较时，发现BFA处理并未显著改变FABP4、LPL等成脂标志物的诱导上调趋势。同样，ATF6、CREB3、ARF4和NR3C1在分化过程中的下调模式也未因BFA的急性处理而发生根本性逆转。这说明，在分化第7天施加的短期BFA应激，虽能激活应激基因表达，但不足以逆转或显著改变已启动的成脂分化程序。

本研究成功构建了一个具有长期增殖和稳定分化能力的永生化猪肌内前脂肪细胞系，克服了原代细胞模型的局限性。该模型证实，脂肪生成过程伴随着ER/高尔基体应激通路相关基因（如CREB3、ATF6、ARF4）的下调。利用BFA诱导的急性ER/Golgi应激实验表明，虽然应激条件可以激活CREB3等因子，并对部分成脂标志物产生一定影响，但短暂的应激处理未能完全逆转分化进程。这提示慢性应激与急性应激对脂质代谢的调控可能存在差异。该细胞模型为在更接近人类生理的体系中深入研究ER应激、CREB3信号通路在肌内脂肪生成及代谢综合征中的作用提供了宝贵工具，对未来揭示相关疾病的分子机制具有重要科学意义。