基于栀子苷-精胺纳米载体与杂交红细胞膜包被的高效siRNA递送系统在淋巴母细胞和黑色素瘤中的应用

本研究针对siRNA递送系统中载体不稳定、细胞摄取率低及免疫原性强的难题，开发了一种新型杂交递送系统。研究人员将栀子苷-精胺-甘氨酸纳米颗粒（G10S5）与掺杂了DPPC和DSPE-PEG2000的红细胞膜囊泡（EMVs）相结合，构建了仿生纳米平台。结果表明，该杂交系统显著增强了siRNA的细胞摄取和递送效率，在tdTomato表达的B16F10细胞和淋巴母细胞中均实现了有效的基因沉默，且细胞毒性低。该策略为开发高效、安全的非病毒核酸疗法开辟了新途径，尤其在难转染细胞（如淋巴细胞）的基因治疗中展现出巨大潜力。

　　

基因 silencing therapy（基因沉默疗法）已成为治疗各种遗传性疾病的一种有前景的方法。其成功应用关键在于将治疗性核酸（如小干扰RNA，siRNA）有效递送至靶细胞。然而，裸露siRNA的递送面临多重挑战：易被血清核酸酶降解、肾脏快速清除、以及因其大分子量和负电荷导致的细胞摄取率低。此外，siRNA分子本身可能引发免疫反应，产生促炎细胞因子。更为棘手的是，哺乳动物细胞缺乏有效的双链RNA转运蛋白，且体内环境中RNA酶含量丰富，会迅速切割双链RNA。因此，开发有效的递送系统对于增强siRNA疗法的稳定性、靶向性和生物相容性至关重要。

目前，已有多种siRNA递送平台被开发出来，包括合成纳米颗粒（NPs）和病毒载体。病毒载体虽转染效率高且稳定，但其临床应用受限于高成本和高风险。非病毒系统，如脂质基纳米颗粒（LNPs）、聚合物基纳米颗粒（PNPs）等，作为替代方案被广泛探索。其中，阳离子聚合物纳米颗粒因其与带负电的核酸具有较强的复合能力而被广泛应用。

在此背景下，研究人员将目光投向了一种基于栀子苷（genipin）的阳离子聚合物纳米颗粒（G10S5 NPs）。栀子苷是一种从栀子果实中提取的天然交联剂。G10S5 NPs具有合成简便、生物相容性好、自发光等优点，但其可能面临快速清除和免疫识别的问题。为了克服这些局限，研究人员借鉴了仿生学的思想，尝试用细胞膜对纳米颗粒进行“伪装”。红细胞膜因其来源丰富、易于处理以及独特的膜特性（如长循环时间、免疫系统逃避）成为最常用的包被剂之一。然而，将红细胞膜成功包被到相对柔软的、基于栀子苷的聚合物纳米颗粒上仍是一个挑战。

为此，本研究开发了一种混合递送系统，将G10S5-siRNA复合物（polyplexes）用掺杂了DPPC（二棕榈酰磷脂酰胆碱）和DSPE-PEG₂₀₀₀（二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000）的杂交红细胞膜囊泡（hybrid EMVs）进行包被。研究人员假设，这种杂交膜包被能结合G10S5 NPs的结构优势和EMVs的免疫逃避特性，产生协同效应，从而提高siRNA的递送效率。

为验证该系统的有效性，研究团队开展了一系列表征和功能实验。他们首先成功制备并表征了G10S5 NPs、EMVs、DPPC/DSPE-PEG₂₀₀₀脂质体以及它们的杂交囊泡。通过动态光散射（DLS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、透射电子显微镜（TEM）、冷冻电镜（cryo-EM）和原子力显微镜（AFM）等技术，证实了杂交膜的成功形成以及其对G10S5-siRNA复合物的有效包被，并显示出良好的纳米尺度形态。特别值得一提的是，他们巧妙地利用了G10S5的自发荧光特性，通过溶剂化变色荧光分析间接证明了包被的高效性。

在最优化的磷酸基与氮基（P/N）比例为1:12时，杂交包被的G10S5-siRNA复合物表现出优异的RNase A抗性、强大的siRNA结合能力和储存稳定性。与未包被的对照组相比，体外实验表明，杂交包被的G10S5-siRNA的细胞摄取量显著增强，并且其内化机制与未包被的NPs有所不同。

基因沉默效率的验证分别在两种细胞模型中进行：一是表达tdTomato荧光蛋白的小鼠黑色素瘤B16F10细胞，以证明其在癌症治疗中的潜力；二是在淋巴母细胞系中，靶向FARSA（苯丙氨酰-tRNA合成酶α链）基因，该基因最近被证实与淋巴母细胞系中C9orf72突变的机制相关。值得注意的是，淋巴母细胞（源自Epstein-Barr病毒永生化的淋巴细胞）类似于其亲本淋巴细胞，难以通过非病毒载体进行转染，这限制了例如CAR-T细胞疗法等领域的发展。实验结果表明，杂交包被的G10S5 NPs在这两种细胞系中均实现了有效的基因敲低，且细胞毒性最小。特别是在淋巴母细胞中，杂交系统展现了比未包被G10S5更优越的基因沉默效果，表明其在难转染细胞中的应用潜力。

主要关键技术方法

本研究的关键技术方法包括：1. 纳米颗粒制备：通过栀子苷、精胺和甘氨酸在PBS缓冲液中反应合成G10S5 NPs。2. 膜囊泡制备：采用低渗休克法制备人红细胞膜囊泡（EMVs），并通过薄膜水化法制备DPPC/DSPE-PEG₂₀₀₀脂质体，再将两者通过超声和挤出融合形成杂交膜囊泡。3. 包被过程：通过超声将G10S5-siRNA复合物与杂交膜囊泡共孵育，实现包被。4. 表征技术：综合利用DLS、FTIR、TEM、cryo-EM、AFM等进行物理化学表征；利用荧光光谱（包括FRET分析）和荧光显微镜评估膜融合和细胞摄取。5. 功能验证：通过细胞毒性试验（PrestoBlue法、台盼蓝染色）、内吞途径抑制实验、流式细胞术、qRT-PCR和Western blot等技术评估递送系统的生物安全性、内化机制和基因沉默效率。研究所用红细胞来自卢布尔雅那输血中心。

3.1. 起始材料的制备和表征：G10S5 NPs和伪装膜

研究人员成功合成了G10S5 NPs，并制备了EMVs、脂质体以及它们的杂交囊泡。动态光散射（DLS）显示G10S5 NPs具有双峰尺寸分布，而杂交囊泡的尺寸均一（约134 nm），Zeta电位为负值（-12.9 mV）。通过TEM和cryo-EM观察了各组分的超微结构，确认了它们的形态。为了验证EMVs和脂质体的有效混合，研究人员进行了F?rster共振能量转移（FRET）实验和共聚焦显微镜分析，结果表明超声和挤出处理能实现两种膜的有效融合，形成杂交载体。

3.2. G10S5 NPs与siRNA的复合

通过研究不同P/N比例下复合物的尺寸、Zeta电位和siRNA结合能力，研究人员确定了1:12和1:5为最优P/N比例。这两个比例的复合物均能有效保护siRNA免受RNase A降解，并且结合稳定。

3.3. 伪装G10S5-siRNA的表征：脂质体、EMVs及其杂交物

尝试用纯脂质体包被G10S5-siRNA成功，但用纯EMVs包被则失败。而使用杂交膜（EMVs掺杂10% w/w脂质体）则成功实现了包被。FTIR光谱提供了包成功的辅助证据。DLS和Zeta电位分析表明，包被后的颗粒尺寸增大，且表面电位与杂交囊泡一致。冷冻电镜和原子力显微镜（AFM）图像进一步证实了核心-壳结构的形成。尤为巧妙的是，研究人员利用G10S5的自发荧光特性，通过溶剂化变色效应（在不同P/N比例下荧光光谱的偏移和强度变化）间接证明了包被效率与复合物表面负电荷密度相关，负电性越强，包被效果越好。

3.4. G10S5-siRNA-杂交物的细胞毒性

细胞毒性实验表明，空载的囊泡（EMVs或脂质体）在所测试浓度范围内对正常人肺成纤维细胞（NHLF）和小鼠黑色素瘤细胞（B16F10）均无毒性。包被和未包被的G10S5-siRNA在低浓度下（用于转染的浓度）也显示出良好的生物相容性。

3.5. B16F10细胞中的内化研究

通过使用不同的内吞途径抑制剂（如genistein, chlorpromazine, imipramine），研究人员发现未包被的G10S5主要通过网格蛋白（clathrin）介导的内吞作用进入细胞。而杂交膜包被的G10S5则主要通过小窝蛋白（caveolae）介导的内吞作用和巨胞饮作用（macropinocytosis）进入细胞，这表明包被显著改变了纳米颗粒的细胞摄取机制，并总体上增强了细胞摄取效率。

3.6. 小鼠黑色素瘤和淋巴母细胞中的基因敲低功效：降低有效剂量

基因沉默实验结果表明，在B16F10-tdTomato细胞中，杂交包被的G10S5-siRNA（1:12 P/N）在低剂量（5 pmol）下即可显著降低tdTomato蛋白的荧光强度（MFI降低约30%），而未包被的G10S5效果甚微。值得注意的是，在低剂量下，观察到的是蛋白质水平的敲低而非mRNA水平的显著下降，提示可能存在翻译抑制机制。在淋巴母细胞中，靶向FARSA蛋白的siRNA通过杂交包被的G10S5递送，在20 pmol剂量下即可实现高达约83%的蛋白敲低效率，效果远优于未包被的G10S5，凸显了该杂交系统在难转染细胞中的强大应用潜力。

讨论与结论

本研究成功开发了一种基于G10S5聚合物纳米颗粒和杂交红细胞膜的新型siRNA递送平台。研究揭示了杂交膜包被的成功依赖于两个关键因素：静电相互作用和机械性能的匹配。掺杂DPPC和DSPE-PEG₂₀₀₀有效地调节了纯红细胞膜的机械性能，使其能够更好地包裹G10S5-siRNA复合物。包被不仅改变了纳米颗粒的细胞摄取途径，增强了内化效率，还显著降低了实现有效基因沉默所需的siRNA剂量。

该研究的创新之处在于首次将红细胞膜杂交包被策略成功应用于相对柔软的栀子苷基聚合物纳米颗粒，并系统阐述了其包被机制、细胞摄取行为以及基因沉默效果。特别是在淋巴母细胞这类难转染细胞中展现的高效基因敲低能力，为基于核酸的疗法（如针对C9orf72突变相关疾病的治疗）提供了新的工具。此外，研究中所用的G10S5 NPs的自发荧光特性为无标记监测包被效率和细胞命运提供了便利。

总之，这项研究通过巧妙的仿生设计，将天然膜的特性与合成聚合物的多功能性相结合，有效解决了传统siRNA递送载体的局限性。这种杂交膜伪装G10S5纳米颗粒作为一种有前景的siRNA递送平台，不仅为基因治疗领域提供了新思路，也为开发下一代生物相容性更好的核酸药物奠定了基础。未来，进一步的功能化（如主动靶向修饰）和体内评价将推动该平台向临床应用迈进。