高通量SH2域置换解析BTK自抑制机制：静电相互作用主导的进化保守调控模式

本研究通过高通量SH2域置换技术系统解析了布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）的自抑制机制。研究发现，尽管BTK缺乏类似Src/Abl激酶的典型分子闩锁结构，但其SH2域与激酶域间的分布式静电相互作用（如Arg307-Asp656离子对）对维持自抑制构象至关重要。通过构建249种嵌合BTK蛋白并利用Jurkat T细胞和Ramos B细胞功能筛选模型，首次发现51%的异源SH2域可增强BTK功能，揭示其自抑制界面具有可塑性。该工作为癌症治疗中BTK靶向药物耐药机制提供新见解。

　　

Significance

布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）作为Tec家族酪氨酸激酶的重要成员，在癌症治疗中具有重要靶点价值。与Src和Abl激酶不同，BTK缺乏明显的分子内闩锁结构来稳定其自抑制状态。本研究通过高通量方法替换数百种SH2域，发现SH2域通过静电相互作用稳定BTK的自抑制构象，表明特化闩锁机制是后期进化精细化的结果。

Abstract

BTK与Src和Abl激酶相似，其SH2-SH3模块通过SH3域与激酶域的抑制性相互作用调控激酶活性。然而BTK缺乏明显的SH2-激酶域闩锁。为评估SH2域在BTK自抑制中的作用，研究团队构建了数百种嵌合BTK分子，并通过T细胞和B细胞高通量检测其适应性。结果显示许多异源SH2域可增强BTK功能，分布式SH2-激酶域相互作用是稳定自抑制构象的关键。

引言背景

SH2域的发现革新了对酪氨酸激酶信号传导的理解。在Src、Abl和Tec家族激酶中，SH2域存在于古老的"Src模块"中。Src激酶中C末端尾部磷酸化酪氨酸与SH2域形成闩锁，Abl则通过N末端豆蔻酰基实现类似功能。BTK虽具有相似的自抑制构象，但其SH2-激酶域界面结合较松散，仅依赖Arg³⁰⁷-Asp⁶⁵⁶离子对维持自抑制。临床发现的T316A突变导致伊布替尼耐药，提示该界面重要性。

Results

嵌合BTK蛋白库设计

研究团队构建了替换人类BTK SH2域的蛋白库，边界定义为PFAM数据库中BTK的281-362位残基。通过计算管道筛选脊椎动物Tec激酶SH2序列、祖先序列重建序列及非Tec激酶SH2域（如SRC、ABL1），最终获得249个SH2域变异体。对照组包含破坏磷酸酪氨酸结合的R307K突变及终止密码子突变。

嵌合蛋白适应性与丰度检测

采用Jurkat T细胞和Ramos B细胞CD69上调实验测定适应性。通过RNA-seq定量输入库和分选库中变异体读数，计算公式为：Fitness_i = log₁₀(SortCount_i/InputCount_i) - log₁₀(SortCount_{wild type}/InputCount_{wild type})。实验显示生物学重复间高度一致（Pearson R ≥ 0.65）。通过C末端mGreen-Lantern标签检测蛋白丰度，排除表达差异对功能影响的干扰。

SH2域磷酸酪氨酸识别功能验证

R307K突变显著降低61个高同源性SH2嵌合体的适应性（Jurkat实验57/61，Ramos实验50/61），证实磷酸酪氨酸识别对BTK功能不可或缺。丰度实验表明该突变对蛋白稳定性影响较小，说明适应性下降主要源于功能丧失而非表达变化。

异源SH2域增强BTK功能的现象

令人惊讶的是，51%（128个）SH2域置换体展现出高于野生型的适应性。系统发育分析显示BMX和TXK类SH2域在两种细胞实验中均显著增强功能，且与蛋白丰度变化无关。祖先序列重建发现BMX-H序列（含N285D/A289S/R310S/A312V突变）适应性逐步增加，这些位点位于SH2-激酶域界面，提示界面破坏可能导致功能增益。

激酶域突变验证自抑制机制

通过构建118个αI^kinase helix变异体库，在野生型BTK和BMX-H SH2背景中平行筛选。发现鲸鲨（Rhincodon typus）和TEC来源的αI^kinase序列在野生型中降低适应性，但在BMX-H背景中无影响。Alphafold模型显示这些变异增加激酶域负电荷，与带正电的BTK SH2域界面互补，进一步证实静电相互作用在自抑制中的核心作用。

Discussion

本研究揭示BTK自抑制依赖SH2-激酶域界面的分布式静电相互作用，而非特化闩锁机制。多数异源SH2域可通过破坏该界面增强BTK功能，说明磷酸酪氨酸靶向功能具有模块化特性，而自抑制功能需要特异性共进化。该发现为理解古老Src模块的调控进化提供新视角，对针对自抑制界面的药物设计具有指导意义。

Methods

祖先序列重建

从PFAM数据库获取59,304个SH2域序列，通过最大似然法和PAML软件重建114个祖先节点。采用边际重建和联合重建两种策略处理序列间隙，最终获得249个测试序列。

高通量克隆与检测

通过Golden Gate组装法将SH2域序列嵌入BTK基因框架，构建慢病毒文库。采用流式分选GFP⁺CD69⁺细胞群体，RNA-seq定量变异体频率。αI^kinase库使用条形码标记技术实现双背景平行筛选。

数据分析

使用Kallisto软件比对测序读数，设定输入库≥50读数的质量控制阈值。适应性计算采用对数比值标准化法，所有分析代码公开于GitHub平台。