白细胞力学表型分析自动化框架的建立及其在变形性细胞术中的应用

本研究针对无标记白细胞（WBC）亚型分类的可靠性难题，开发了基于盒式过滤器和无监督聚类的全自动分类框架。该方法利用高精度分割提取的细胞形态特征和明场图像纹理特征，在六种实验条件下验证了其鲁棒性，显著提升了白细胞力学表型分析的准确性、可重复性和通量，为大规模队列研究奠定了基础。

　　

在生物医学研究领域，细胞的机械特性（mechanophenotyping）正成为识别疾病状态的重要生物标志物。变形性细胞术（Deformability Cytometry, DC），特别是剪切流变形性细胞术（shear flow Deformability Cytometry, sDC），是一种强大的生物物理技术，它能够以低成本、高通量的方式表征血液细胞力学特性的疾病相关变化。其中，活体白细胞（White Blood Cells, WBCs）的力学分析极具价值，因为它们在免疫应答中扮演着关键角色。然而，在无标记（label-free）的条件下，可靠地识别和分类白细胞亚型一直是一个巨大的挑战。长期以来，分析流程依赖于训练有素的专家进行手动设门（manual gating），这种方法不仅可扩展性差，而且难以保证结果的可重复性，限制了该技术的广泛应用。

为了应对这一挑战，由Sara Kaliman、Shada Abuhattum、Benedikt Hartmann和Jochen Guck组成的研究团队开展了一项研究，旨在建立一个全自动且普适性的白细胞分类框架。他们的研究成果发表在《Biophysical Journal》上，题为“Automation and Improvement of WBC Mechanical Profiling in Deformability Cytometry”。这项研究的核心目标是克服现有监督学习模型的局限性——这些模型需要大量的训练数据，并且在成像条件变化时性能往往会下降。

研究人员开发的分析框架主要基于两个关键技术：盒式过滤器（box-filters）和无监督聚类（unsupervised clustering）。这两种方法都依赖于从细胞图像中提取的两类特征。第一类是通过高精度分割（high-accuracy segmentation）获得的细胞形状特征（cell shape features）。值得注意的是，本研究采用了基于原始轮廓（original contour）的形状特征，而非常用的凸包（convex hull），这提高了形态学测量的准确性并减少了变异性。第二类是从明场图像（bright-field images）中提取的细胞纹理特征（cell texture features）。这种无监督的方法避免了对于预先标注数据的依赖。

为了验证该方法的可靠性和鲁棒性，研究团队设计了包含六个实验组（experimental sets）的验证方案。这些实验组综合考虑了多种现实世界中可能存在的变量：不同的血液捐献者、两种抗凝剂（EDTA和柠檬酸盐 citrate）、两种血液采集来源（毛细血管 capillary 和静脉血 venous）以及设备亮度设置（device brightness settings）的变化。每个实验组还包含了五次重复测量，以评估方法的稳定性。通过将自动化分类结果与专家手动设门得到的结果进行比较，研究证实了该方法在所有测试条件和所有白细胞类型下的一致性和可靠性。

此外，该自动化流程的一个重要优势是能够纳入那些通常被标准分析排除在外的、带有膜突起（membrane protrusions）的白细胞。这使得研究人员能够对可能处于激活状态的细胞进行形态学表征，为免疫细胞功能研究开辟了新的视角。

主要技术方法

本研究关键技术方法包括：基于剪切流的变形性细胞术（sDC）用于高通量细胞力学表征；高精度图像分割算法以提取细胞原始轮廓；从明场图像中提取细胞形态和纹理特征；基于盒式过滤器和无监督聚类（如K-means）的自动化细胞分类流程；使用来自不同供体、抗凝剂（EDTA/柠檬酸盐）、采血来源（毛细血管/静脉血）的样本队列进行方法验证。

研究结果

自动化框架实现可靠分类

通过比较自动分类与手动设门在多个实验条件下的结果，研究人员发现，基于形态和纹理特征的无监督聚类能够清晰地区分不同的白细胞亚群。该框架不仅复制了专家手动分析的主要结果，而且在处理不同实验变量（如抗凝剂类型）时表现出更强的稳定性，显著减少了人为干预带来的偏差。

方法展现跨条件鲁棒性

在包含血液来源、抗凝剂、设备设置等变量的六个实验组中，自动化分类方法均保持一致性能。重复性测量结果显示，细胞亚群的分类结果具有高度可重复性，证明了该方法适用于大规模、多中心的临床研究场景，克服了传统监督模型对特定成像条件的依赖性。

纳入非典型形态细胞拓展分析维度

传统的分析往往排除具有膜突起的细胞。本研究的新方法成功地将这类细胞纳入分析范围，并对其独特的形态特征进行了量化。这表明该框架能够捕获更广泛的细胞状态，对于研究免疫激活等过程具有潜在价值。

原始轮廓特征提升形态学精度

与使用凸包近似的方法相比，直接采用原始轮廓计算形状特征（如长宽比、不规则度）显著提高了形态学参数的准确性。这种改进降低了测量变异性，使得对细胞细微形态变化的检测更加灵敏。

研究结论与意义

本研究成功地开发并验证了一个用于剪切流变形性细胞术（sDC）的全自动、无监督白细胞分类框架。该框架的核心优势在于其高鲁棒性、可重复性以及无需大量标注数据即可应用的特性。通过系统性地验证多种实验变量下的性能，研究证实该方法能够克服当前基于监督学习模型的主要限制，为白细胞力学表型（WBC mechanophenotyping）的高通量分析提供了可靠的工具。

其重要意义体现在多个层面：在技术层面，它提升了变形性细胞术数据分析的自动化水平和准确性，特别是通过使用原始轮廓特征和改进的聚类策略。在科学层面，该方法允许纳入更广泛的细胞形态，包括可能被激活的细胞，为免疫细胞力学与功能关联的研究提供了新的可能性。最后，在应用层面，该方法的高通量和强鲁棒性使其非常适合应用于大规模临床队列研究，有望加速基于细胞机械特性的疾病诊断和监测标志物的发现。这项研究标志着向实现标准化、可扩展的细胞力学分析迈出了关键一步，具有广阔的临床应用前景。