基于微滴阵列的蒸发驱动数字ELISA技术实现低丰度蛋白质超快检测

本研究针对传统免疫分析检测限高、耗时长的问题，开发了一种无磁珠、无油相的蒸发驱动数字ELISA新方法。通过飞升级微滴的循环蒸发/再生，利用气-液界面富集效应和蒸发诱导对流，显著提升抗原-抗体结合效率。对心肌肌钙蛋白I的检测限达64.23 fM，较96孔板ELISA提升280倍，结合时间从120分钟缩短至1.76分钟。该技术为床旁检测提供了简单高效的解决方案。

　　

在临床诊断中，蛋白质生物标志物的早期检测对疾病干预至关重要。然而，许多传统免疫分析方法如酶联免疫吸附测定（ELISA）存在检测限高、孵育时间长等局限，难以实现低至亚飞摩尔浓度的检测。虽然商品化数字ELISA平台（如SimOA）已能实现单分子检测，但其依赖磁珠、油相乳化及复杂流体控制系统，导致设备笨重昂贵，限制了在床旁诊断场景的广泛应用。

为解决这一难题，韩国科学技术研究院脑技术中心的研究团队在《Biosensors and Bioelectronics》发表了一项创新研究，开发了一种基于微滴阵列（MDA）的蒸发驱动数字ELISA（dELISA）技术。该技术通过飞升级微滴的循环蒸发，在无磁珠、无油相的开放微流控环境中实现了低丰度蛋白质的超快检测。

研究人员采用光刻技术在玻璃基底上构建亲/疏水微图案阵列，通过气相沉积氟烷基硅烷（FDTS）形成疏水区域，暴露的亲水玻璃点（直径5 μm）用于抗体固定。利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）和聚酰亚胺胶带组装微流控通道，通过垂直放置装置和注射泵控制，使20 μL母液滴反复滑过表面，在亲水点上形成约30 fL的半球形微滴。这些微滴在<1秒内蒸发，每2.5秒完成一个循环，通过蒸发富集效应和对流作用增强抗原-抗体结合。

3.1. 微图案器件的制备与液滴生成

亲水点阵列（400×935阵列/通道）经聚乙二醇（PEG）修饰后保持亲水性，抗体固定后仍能稳定生成均匀微滴。PDMS密封的微流控通道使液滴可稳定存在超过6小时，满足酶-底物反应需求。

3.2. MDA数字ELISA的检测限提升

针对IgG-HRP的检测限达954.11 aM，较96孔板ELISA提升5,827倍。以心肌肌钙蛋白I-C复合物（cTnI-C）为靶标时，检测限为206.32 fM（静态孵育120分钟），而100次蒸发循环（4.17分钟）和300次循环（12.5分钟）分别将检测限提升至118.46 fM和64.23 fM。

3.3. 蒸发参数对免疫反应的影响

间隔时间（2.5秒 vs 25秒）和湿度（30%-70% RH）对结合效率无显著影响。非特异性吸附实验表明，蒸发驱动的特异性结合占比达82.95%，与静态孵育（79.94%）相当。

3.4. 蒸发循环次数增强免疫反应

随着蒸发循环次数增加，荧光阳性液滴数量线性增长（R²>0.96）。理论模型显示，阳性信号率与循环次数符合泊松分布，实验数据与模型高度吻合（λ_e/k=3.95×10^-4-3.90×10^-5）。

3.5. 蒸发循环对免疫反应的增强效果

100 pM cTnI-C的相同结合量在静态孵育中需120分钟，而蒸发循环仅需1.76分钟，结合速度提升68倍。干扰实验表明，在1,000倍摩尔浓度干扰蛋白（BSA、纤维蛋白原、人IgG）存在下，仍能特异性检测cTnI-C。血浆加标回收率>86%，虽需间歇清洗防止疏水表面污损，但验证了实际样本适用性。

该研究通过迭代蒸发循环实现了飞升级微滴的高效表面结合，显著加速了低丰度蛋白质的检测速度并降低检测限。与传统方法相比，蒸发驱动dELISA在保持高特异性的同时，将检测时间从小时级缩短至分钟级，且无需复杂外部设备。尽管存在样本消耗量较大、缓冲液成分浓缩抑制反应等挑战，但通过开放微流控技术优化后可实现纳升级消耗。该技术为微点阵表面增强拉曼光谱、局域表面等离子体共振等应用提供了新思路，有望推动床旁数字免疫分析的发展。