乳酸脱氢酶A温度适应性进化中的关键位点收敛及其对鱼类热极限预测的启示

本研究通过跨物种分析277种鱼类乳酸脱氢酶A（LDH-A）同源物，结合生物信息学、分子动力学模拟与定点突变技术，揭示了温度适应性进化在少数关键蛋白区域（TRSS）的收敛现象。研究发现关键位点的氨基酸替换通过调节疏水性影响酶结构与功能稳定性，并基于此开发了可预测鱼类热极限的深度学习模型，为物种温度适应性机制研究提供了新范式。

　　

乳酸脱氢酶A（LDH-A）作为糖酵解途径的关键酶，其结构与功能的温度适应性对生物热适应范围具有决定性影响。本研究通过整合277种海洋鱼类LDH-A同源物的序列数据，结合生物信息学分析、蛋白质结构预测（ColabFold）、分子动力学模拟（Gromacs）及定点突变（SDM）实验，系统揭示了温度适应性进化在蛋白特定区域的收敛规律。

LDH-A序列在广温适应鱼类中的特征

研究样本覆盖从极地（-1.6°C）到赤道（29.5°C）生境的鱼类，涵盖29个目级分类群，演化历史可追溯至三叠纪。序列比对显示，LDH-A在332个氨基酸位点中高度保守，但存在127个替代位点。值得注意的是，替代位点非随机分布：活性中心关键残基（如His193、Arg106、Arg169、Asp166）完全保守，而变异主要集中在催化过程中发生构象变化的移动区域（MRs），包括αD螺旋、α1G-2G螺旋和αH螺旋周边区域。这些区域通过开合运动调控底物（NADH/丙酮酸）进出活性中心，其灵活性直接影响催化效率。

热适应相关序列位点（TRSS）的鉴定与验证

通过二项回归分析与方差检验，从127个替代位点中筛选出18个与生境温度显著相关的TRSS。其中4个位于MRs区域（如230#、233#、310#、317#），2个邻近活性中心二级结构（173#、174#）。氨基酸使用模式显示：异亮氨酸（Ile）多见于冷适应变异型，亮氨酸（Leu）和甲硫氨酸（Met）则偏向暖适应型。但同一氨基酸在不同位点可能呈现相反的温度适应性（如190#位点缬氨酸（Val）为冷适应型，230#位点亮氨酸（Leu）为冷适应型），表明残基功能受局部微环境调控。

结构稳定性与动力学关联

分子动力学模拟显示，8种LDH-A同工酶的骨架柔性（ΔRMSD）与物种适应温度呈负相关（R²=0.91），证实暖适应酶具有更高刚性。RMSF分析进一步揭示MRs区域在30°C时波动性显著增强。对TRSS的结构特征量化发现：16个位点的疏水性（通过SASA与RSA评估）呈现温度适应性分化，其中11个位点的暖适应变异型疏水性更强。氢键数量与距离分析表明，部分TRSS通过增强氢键网络提升热稳定性。

通过斑马鱼LDH-A的定点突变实验，7个TRSS变异体的功能验证表明：5个关键TRSS（L173I、M174I、V190I、V230I、M233E）显著影响酶动力学特性。暖适应变异体在30°C时表现出更低的丙酮酸米氏常数（K_m^PYR）及更高的热稳定性（50°C孵育后残留活性），证实这些位点通过调控局部疏水性影响催化过程中的构象变化速率。

物种热极限的深度学习预测

基于5个关键TRSS的结构参数（氢键数量/距离、SASA、RSA）与功能分类，构建图神经网络（GNN）与梯度提升模型（XGBoost）联合框架。模型对物种热上限（T₉₉）预测的均方误差（MSE）为32.97（R²=0.58），对热下限（T₀₁）预测的MSE为41.32（R²=0.44），证明生化特征可有效预测宏观热适应性状。

讨论与展望

本研究从大规模跨物种比较中揭示了LDH-A温度适应的收敛进化机制：少数关键位点的氨基酸替换通过调控移动区域疏水性，而非改变活性中心直接作用位点，实现酶功能的热适应性优化。深度学习模型的成功构建，为缺乏生理学数据的物种提供了热极限预测工具，在气候变化背景下物种分布模拟、渔业资源保护等领域具有应用潜力。未来可拓展至其他关键酶系及陆生生物类群，深化对温度适应性进化普适规律的认识。