综述：微生物合成吡嗪的风味化学与代谢工程：解码食品香气成分绿色制造之路

本综述系统梳理了微生物合成吡嗪的研究进展，重点解析了以氨基酸（如L-苏氨酸）和葡萄糖代谢为核心的多条生物合成途径及其关键酶（如TDH、ALS、ALDC、OMT），评估了利用廉价碳源（如工农业废料）的绿色制造策略，并探讨了解决产物产量低、微生物耐受性差等挑战的可行性方案（如代谢工程、无细胞系统），为吡嗪类食品风味剂和医药中间体的高效生物制造提供了理论指导和发展路线图。

　　

引言

吡嗪是一类广泛存在于自然界中的1,4-二氮取代苯化合物，以其显著的烧灼或烤坚果香气而闻名。这类化合物具有低蒸气压、易挥发及低香气感知阈值的特点，使其成为多种食品中至关重要的风味成分。吡嗪的风味贡献与其分子结构密切相关，并表现出强烈的嗅觉特性。在食品中，其浓度通常在1 ppm到10 ppm之间。随着人口增长、寿命延长以及对食品安全意识的提高，对生物合成吡嗪的需求日益增加。然而，目前大多数吡嗪仍通过化学合成商业化生产，存在过程能耗高、可能产生外消旋混合物带来不良杂味等问题。相比之下，微生物发酵合成具有高立体特异性、过程绿色温和以及产物风味和谐等优势，代表了未来的绿色制造方向。

1. 吡嗪的生物合成途径

1.1. 氨基酸代谢途径

氨基酸代谢途径是吡嗪生物合成中较为常见的途径之一。丙氨酸（Ala）和甘氨酸（Gly）是美拉德反应（MR）中形成吡嗪的两个主要底物，它们不仅提供氮源，还参与了一些烷基吡嗪烷基侧链的构成。在某些微生物中，赖氨酸（Lys）也参与吡嗪的生物合成。L-苏氨酸（L-thr）是合成吡嗪的重要底物，例如2,5-二甲基吡嗪（2,5-DMP）和2,3,5-三甲基吡嗪（TMP）的合成前体常来源于L-thr的代谢物。在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中，L-thr可通过L-苏氨酸-3-脱氢酶（TDH）催化生成2-氨基-3-酮基丁酸（AKB），后者可非酶促脱羧生成氨基丙酮，氨基丙酮可进一步通过非酶促二聚和脱水反应生成2,5-DMP。此外，B. subtilis还能利用氨基丙酮和2,3-戊二酮作为关键中间体，在温和条件下生物合成2-乙基-3,5(3,6)-二甲基吡嗪（EDMPs）。对于甲氧基吡嗪，如3-异丁基-2-甲氧基吡嗪（IBMP），其生物合成途径的最后一步涉及羟基吡嗪在O-甲基转移酶（OMT）催化下发生甲基化反应。

1.2. 葡萄糖代谢途径

葡萄糖代谢途径也是吡嗪生物合成的重要途径之一。葡萄糖可通过糖酵解途径转化为乙酰乳酸，进而生成乙偶姻（3-羟基-2-丁酮）。乙偶姻是甲基吡嗪（如TMP、TTMP）的重要前体。研究人员开发了一种基于温控两步法的高效TTMP合成策略：首先利用B. subtilis在37°C下将葡萄糖生物转化为乙偶姻，然后在95°C高温下通过磷酸二铵介导的自发转化生成高纯度的TTMP晶体。该策略通过分阶段温控耦合生物和化学过程，为TTMP的绿色高效合成提供了创新路径。在吡嗪的生物合成中，L-thr代谢已被广泛证明是构建吡嗪骨架的中心途径。为了增强这一代谢通量，代谢工程策略被用于在微生物中异源表达关键的L-thr生物合成基因，以提高2,5-DMP等目标产物的产量。

1.3. 新发现的生物合成途径

近年来，随着研究的深入，一些新的吡嗪生物合成途径被揭示。在某些极端环境微生物（如嗜盐菌Halomonas elongata）中发现了依赖于特殊辅酶的吡嗪合成途径。海洋微生物由于其特殊的高盐、低温等环境，也进化出了不同于陆地微生物的代谢模式，能够产生结构独特的吡嗪类化合物。例如，从海洋沉积物中分离的链霉菌（Streptomycessp.）中鉴定出了两种结构新颖的吡嗪生物碱化合物。这些新途径的发现为拓展吡嗪的结构多样性和生物合成能力提供了新的资源和方法。

2. 生物合成过程中的关键酶

2.1. 转移酶

转氨酶（Tra）通过催化氨基转移反应，为吡嗪环的形成提供关键前体。它们具有广泛的底物特异性，能够作用于多种氨基酸和α-酮酸。在美拉德反应之前，蛋白质或氨基酸首先由立体选择性的Tra介导特定氨基供体的胺化作用，随后通过氧化二聚形成吡嗪环结构。O-甲基转移酶（OMT）是甲氧基吡嗪合成中的关键酶，负责催化羟基吡嗪的甲基化步骤。目前在葡萄等植物中已鉴定出多个参与甲氧基吡嗪生物合成的OMT基因（如VvOMT1-4）。

2.2. 脱氢酶

脱氢酶在吡嗪生物合成的多个方面发挥作用。L-苏氨酸-3-脱氢酶（TDH）是一种NAD依赖型酶，催化L-thr侧链羟基的脱氢反应，生成不稳定的2-氨基-3-酮基丁酸（AKB），后者可自发脱羧生成氨基丙酮。氨基丙酮被认为是形成2,5-DMP等吡嗪的关键中间体。其转化为2,5-DMP存在非酶促和酶促两种可能途径，主导机制受物种特异性和环境条件调控。2,3-丁二醇脱氢酶（BDH）是TTMP合成中的关键酶之一，它催化乙偶姻和2,3-丁二醇（2,3-BD）之间的相互转化，影响着TTMP的最终产量。通过敲除bdhA基因可以阻断乙偶姻向2,3-BD的转化，从而增加乙偶姻的积累，进而提高TTMP的产量。

3. 利用廉价碳源合成吡嗪的途径方案

底物成本通常占微生物发酵过程总成本的20%–40%，是影响吡嗪合成成本的重要因素。葡萄糖是吡嗪合成的主要碳源，但价格相对较高。许多工业副产品、农业或林业废弃物以及一些高糖含量的水果和蔬菜，如糖蜜、玉米秸秆、麦麸、木质纤维素、甘蔗渣等，可以作为微生物利用的原料。这些材料来源广泛、可再生且价格低廉，适合用于替代葡萄糖作为吡嗪合成的碳源。预处理是释放废弃物价值的关键第一步，无论是优化白酒酒糟的酸处理以提高产量，还是对甘蔗糖蜜进行硫酸处理以去除抑制剂，预处理都发挥着不可或缺的作用。通过整合“预处理 → 工程菌株 → 发酵优化”策略，可以有效地将广泛可得、低成本的废弃碳源转化为高价值的吡嗪及其前体，展现出显著的成本优势。

4. 吡嗪生物合成的限制因素与产物耐受性挑战

吡嗪的生物合成是一个涉及多种酶的复杂过程。合成途径中相关酶（如α-乙酰乳酸脱羧酶、α-乙酰乳酸合成酶）的编码基因发生突变会抑制吡嗪的合成。此外，参与吡嗪合成的微生物菌株和酶的活性受温度、pH、光照等环境因素的影响。烷基吡嗪主要来源于美拉德反应（MR）和微生物代谢。美拉德反应的效果与反应时间、温度、pH等多种因素高度相关。微生物对底物的耐受性也是影响吡嗪合成速率的主要因素。例如，乙偶姻是TTMP的前体，但对细胞有毒性，其浓度的增加会降低微生物的代谢速率，阻碍吡嗪产量的进一步提高。代谢途径竞争或代谢途径的改变也会影响吡嗪合成。此外，基因工程技术的使用，如外源基因的异源表达，会给宿主细胞带来代谢负担，细胞内NAD⁺/NADH比例的失衡会显著影响细胞生长和代谢活动，最终阻碍吡嗪的生物合成。

5. 吡嗪合成前景展望

5.1. 候选菌株的挖掘与改造

吡嗪生物合成目前主要利用两种细菌宿主：枯草芽孢杆菌（B. subtilis，天然途径专家）和大肠杆菌（E. coli，工程化平台）。B. subtilis在天然烷基吡嗪合成方面表现出色，这归功于其内源的乙偶姻途径和自发的非酶促环化反应。其基因改造目前主要集中于前体保留策略（如删除bdhA基因）。相比之下，E. coli需要完整的异源途径工程，但在非天然吡嗪合成方面具有优异的代谢灵活性。其在辅因子平衡（NADH/NADPH）和途径组装方面的工程化成就显著，例如整合L-thr脱氢酶与NADH氧化酶可实现2,5-DMP的高产。未来的研究需要针对不同目标产物和工艺要求，合理选择并进一步优化这些底盘微生物。

5.2. 体外代谢途径研究

体外代谢（in vitrometabolism）可以克服细胞内其他代谢途径的影响，通过精确调控反应条件和底物供应，实现对合成过程的精确控制，获得高纯度、高产率的合成产物。它允许利用来自多种来源的酶系统或细胞提取物进行吡嗪合成，增加了合成吡嗪的多样性。此外，体外代谢不需要整个微生物细胞的生长和繁殖过程，最大限度地减少了环境污染和资源浪费。近年来，创新的原位辅因子再生策略等进展显示了体外合成领域的进步。利用体外代谢工程进行吡嗪生物合成，并优化吡嗪合成途径，可为吡嗪的合成和进一步应用提供新途径。

5.3. 多组学技术解析合成机制

基因组学通过测序和注释吡嗪生产微生物的全基因组，揭示其合成吡嗪的遗传潜力，可识别核心基因簇和潜在功能基因。转录组学通过分析基因表达动力学，可绘制合成途径图谱，揭示关键酶瓶颈和新的调控因子。同位素示踪技术能够通过原子特异性追踪，验证代谢流，明确前体来源和催化节点。例如，利用位置特异性¹³C标记的底物可以确认特定氨基酸作为吡嗪前体的参与。将基因组学、转录组学、代谢组学和同位素示踪等多组学技术整合应用，能够更系统地评估与不同吡嗪类型生物合成相关的各种基因、关键酶和代谢途径的表达差异，解析底物、微生物和代谢物之间的相关性，从而深入探索吡嗪的生物合成机制。

5.4. 吡嗪代谢途径探索的现状

据我们所知，公开文献中尚无描述吡嗪自然降解或代谢的研究，也缺乏关于真菌降解烷基吡嗪的信息。仅有少数研究报告利用细菌分离物降解烷基吡嗪。有研究分离并描述了能够利用各种烷基吡嗪作为唯一碳源和能源的细菌菌株，并初步鉴定了参与细菌降解吡嗪的基因以及TTMP降解途径中的中间代谢物。这些为数不多的报告表明，参与吡嗪降解的代谢途径尚未得到广泛探索。

6. 结论与未来展望

本综述系统总结了微生物吡嗪合成的现有知识体系，识别了以氨基酸和葡萄糖代谢为核心的多条生物合成途径，阐述了TDH、ALS、ALDC、OMT等关键酶的功能作用。通过分析利用廉价碳源的策略，证明了用工农业废弃物替代传统原料进行绿色制造的可行性。同时，揭示了该领域面临的两个核心挑战：一方面，低产物合成效率源于途径解析不完全、关键酶催化能力不足以及细胞内复杂的代谢竞争；另一方面，微生物宿主对吡嗪及其前体的耐受性差，严重限制了高产菌株的构建和发酵工艺的优化。

为推动当前实验室成果走向工业化应用，未来研究可聚焦于以下可操作性技术路径：在机制解析层面，需结合同位素标记与高分辨率质谱追踪中间体，并利用适应性实验室进化技术筛选耐受突变株，通过全基因组测序比较精准识别关键耐受基因。在合成系统构建方面，可细胞内利用CRISPRi等技术动态调控核心代谢网络（如丙酮酸节点），同时异源组装高活性脱氢酶、转氨酶等；细胞外则开发整合脱氢酶、转氨酶及辅酶再生模块的无细胞系统，实现一锅法合成。最后，在工艺整合上，需针对不同复杂原料开发靶向酶法预处理以消除抑制剂，并设计智能发酵策略，最大化终产物的时空产率。

综上所述，尽管微生物合成吡嗪展现出巨大潜力，但从基础研究到产业化的道路仍充满挑战。通过实施上述具体研究策略，有望系统克服现有瓶颈，建立具有成本竞争力的绿色制造路径，推动其大规模应用。