《Environmental Pollution》：Phthalate exposure to adult mice alters non-coding RNAs in cauda epididymosomes
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本研究通过给小鼠暴露于邻苯二甲酸丁酯（DBP）和邻苯二甲酸二乙基己酯（DEHP）及其混合物，分析附睾小体中非编码RNA（ncRNA）谱的变化。发现ncRNA类型以piRNA（47%）、tRFs（34%）和miRNA（6%）为主，并鉴定出79个差异表达的ncRNA，涉及组织发育、嗅觉感知和钾通道活性相关基因。首次证实环境内分泌干扰物可改变附睾小体ncRNA组成，提示其对生殖健康和后代发育的影响。
奥拉德莱·A·奥卢瓦约塞（Oladele A. Oluwayiose）| 卡罗琳娜·诺瓦克（Karolina Nowak）| 艾米丽·霍尔（Emily Houle）| 亚历山大·苏沃罗夫（Alexander Suvorov）| J.理查德·皮尔斯纳（J.Richard Pilsner）
C.S.莫特人类成长与发展中心，韦恩州立大学医学院妇产科，美国密歇根州底特律市48201
摘要
我们之前报告了在接受生育治疗的男性精液中，抗雄激素邻苯二甲酸盐的尿液生物标志物与细胞外囊泡（EVs）中的小非编码RNA（sncRNA）组成之间的关联。为了补充这些发现，我们评估了小鼠在接触抗雄激素邻苯二甲酸盐（二丁基邻苯二甲酸盐DBP、二（2-乙基己基）邻苯二甲酸盐DEHP及其混合物）后，尾部附睾小体的sncRNA情况。
雄性小鼠每天暴露于2.5毫克/千克的DBP或DEHP及其混合物（各2.5毫克/千克）六周。然后分离尾部附睾小体的RNA，并对其非编码RNA（ncRNA）含量进行测序。使用STAR对齐工具和EdgeR软件（变化倍数FC ≥ 1.5且p < 0.01）将测序结果与对照组进行比较，以分析差异表达。
测序结果显示，尾部附睾小体中的RNA主要为piRNA（47%），其次是tRF（34%）和miRNA（6%）。邻苯二甲酸盐暴露改变了79种尾部附睾小体sncRNA的类型（DBP = 47种；DEHP = 11种；混合物 = 21种），其中包括miRNA（14种）、tRF（5种）和piRNA（60种）。这些ncRNA被预测与多种功能过程相关，包括组织发育、嗅觉感知和钾通道活性。
据我们所知，这是首次研究表明，成年雄性小鼠接触邻苯二甲酸盐会破坏尾部附睾小体的ncRNA谱型。这些数据表明，尾部附睾小体的ncRNA对环境因素具有响应性，可能对后代的健康和发育产生影响。
引言
睾丸后的精子成熟是一个关键且复杂的过程，它增强了精子在通过附睾的一到两周过程中的受精能力。精子成熟的核心是与附睾小体的相互作用和分子物质的交换，附睾小体是由附睾上皮分泌到细胞外空间的纳米级膜结合的细胞外囊泡（EVs）（Trigg等人，2019年）。尽管附睾小体体积很小（30-150纳米），但它们包含多种生物活性分子，如胆固醇、蛋白质、脂质和核酸（包括DNA）以及编码和非编码RNA（sncRNA）（Barrachina等人，2022年；Belleannee等人，2013年；Reilly等人，2016年；Vojtech等人，2014年；Zhou等人，2018年）。值得注意的是，已有研究表明，在精子迁移、储存和射精过程中，附睾小体的ncRNA会转移到精子中（Du等人，2016年；Jodar，2019年；Sharma等人，2016年；Sharma等人，2018年）。虽然最近有研究提出了精子携带的sncRNA的其他来源（Wang等人，2023年），但附睾小体中的ncRNA与其在精子中对应靶标之间的表达谱相关性表明它们具有重要的生物学意义（Rompala等人，2018年；Sharma等人，2016年；Trigg等人，2019年）。
精液EV中的ncRNA已被认为对生殖成功有重要贡献，包括精子获能、顶体反应、早期胚胎发育、活产以及后代的健康（Ding等人，2021年；Larriba等人，2023年）。EV中的ncRNA还与男性生殖健康的多种临床结果有关。例如，我们团队最近发现，在临床诊断为不育或未能成功活产的男性中，精液EV中的大量ncRNA亚型存在差异表达（Oluwayiose等人，2022年；Oluwayiose等人，2023a）。这些结果表明，EV来源的ncRNA可作为生殖结果的标志物。
重要的是，已有研究表明多种外部因素可以诱导啮齿动物附睾小体中ncRNA表达水平的变化。例如，生命早期的压力（Rodgers等人，2013年；Rodgers等人，2015年）、营养因素（Chen等人，2016b年；De Castro Barbosa等人，2016年；Grandjean等人，2016年；Sharma等人，2016年）和酒精暴露（Bedi等人，2019年；Rompala等人，2018年）会改变附睾小体的ncRNA组成，尤其是microRNA（miRNA）和tRFs。此外，我们团队最近的研究还发现，人类精液EV中的ncRNA与尿液中的二丁基邻苯二甲酸盐（DBP）和二（2-乙基己基）邻苯二甲酸盐（DEHP）代谢物存在关联，这两种邻苯二甲酸盐具有抗雄激素特性，这些代谢物与ncRNA（包括microRNA、tRFs和piwi相互作用RNA（piRNA）有关（Oluwayiose等人，2023b）。我们之前还观察到，在接受不孕治疗的男性中，尿液中的DEHP和DBP代谢物与精子中差异甲基化区域（DMRs）的数量最多（分别为100个和24个）相关（Wu等人，2017年）。最后，与本研究中相同的暴露水平（每天2.5毫克/千克）的DEHP改变了小鼠F1胚胎和胚外组织的表观遗传学和基因表达（Oluwayiose等人，2021年）。综上所述，这些研究表明DEHP和DBP具有很强的诱导小鼠和人类表观遗传变化的潜力。为了补充我们在人类和小鼠中的发现，本研究评估了DEHP、DBP及其混合物对小鼠附睾小体中ncRNA的影响。
研究部分
小鼠
本研究获得了马萨诸塞大学阿默斯特分校动物护理和使用委员会的批准，并按照美国国立卫生研究院关于实验动物护理和使用的指南进行。7-8周大的成年C57BL/6J（B6，JAX # 000664）雄性小鼠分别接受溶剂（50% DMSO）、2.5毫克/千克的DBP或DEHP以及DBP和DEHP的混合物（各2.5毫克/千克）的处理。
尾部附睾小体大小分布
我们评估了从不同处理组随机选取的样本中分离出的附睾小体的粒径分布（图S1）。总体而言，附睾小体的中位粒径为88.5纳米（范围50-257.9纳米），浓度范围为5.5 × 106 – 2.7 × 109个粒子/毫升/纳米（图S1）。
附睾小体ncRNA组成
在所有样本（n = 24）中，约280百万个测序读段中，映射到特定附睾小体ncRNA类型的读段比例如下：piRNA
讨论
在本研究中，我们分析了从成熟雄性小鼠尾部提取的附睾小体的ncRNA组成，并评估了它们在接触广泛存在的环境邻苯二甲酸盐污染物DBP、DEHP及其混合物后的表达情况。附睾小体的ncRNA测序结果显示，大多数映射到多种转录生物类型，其中主要为piRNA（47%），其次是tRF（34%）、miRNA（6%）、circRNA、rRNA和其他RNA（各4%）以及lncRNA（1%）。
CRediT作者贡献声明
J. 理查德·皮尔斯纳（J. Richard Pilsner）：概念构思、研究设计、撰写、审稿与编辑、监督、方法学、数据可视化、项目管理。亚历山大·苏沃罗夫（Alexander Suvorov）：概念构思、撰写、审稿与编辑、研究。艾米丽·霍尔（Emily Houle）：数据可视化、研究、数据整理、撰写、审稿与编辑。卡罗琳娜·诺瓦克（Karolina Nowak）：数据可视化、撰写、审稿与编辑、研究。奥拉德莱·A·奥卢瓦约塞（Oladele A. Oluwayiose）：撰写、审稿与编辑、方法学、数据可视化、研究。
数据可用性声明
数据将在发表后发布在GEO存储库中，网址为GSE267272。
资助
本工作由美国国立卫生研究院的国家环境卫生科学研究所资助（R01-ES028214和R01-ES030942，资助对象为JRP）。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
