Exendin-4通过靶向p53/NF-κB通路改善线粒体功能以对抗顺铂心脏毒性的机制研究

本研究针对化疗药物顺铂（CP）所致心脏损伤中线粒体功能障碍这一关键问题，探讨了胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂Exendin-4（Ex-4）的心脏保护作用及机制。研究人员发现Ex-4能显著恢复CP诱导的H9c2心肌细胞线粒体生物能量学（改善OCR和ECAR），重塑线粒体动力学平衡（上调OPA1/MFN1，下调DNM1/FIS1），并抑制p53和NF-κB通路介导的细胞凋亡（降低caspase-3/7活性，调节Bcl-2/BAX）和炎症反应（降低TNFα/IL6）。该研究为GLP-1受体激动剂作为化疗心脏毒性辅助治疗策略提供了重要的实验依据。

　　

在肿瘤治疗领域，顺铂（Cisplatin, CP）作为一种广泛使用的化疗药物，虽然疗效显著，但其严重的心脏毒性副作用限制了其临床应用。化疗引发的心力衰竭已成为癌症幸存者长期生存面临的严峻挑战，而线粒体功能障碍被认为是CP诱导心脏损伤的核心环节。线粒体作为细胞的“能量工厂”，其功能紊乱会引发一系列连锁反应，包括氧化应激加剧、细胞凋亡通路激活以及炎症反应失控，最终导致心肌细胞损伤和心功能下降。因此，寻找能够有效保护心肌细胞、减轻化疗心脏毒性的辅助治疗策略，已成为心血管药理研究的重要方向。

近年来，胰高血糖素样肽-1（Glucagon-like peptide-1, GLP-1）受体激动剂在心血管保护方面的潜力日益受到关注。这类药物最初用于治疗2型糖尿病，但研究发现其具有独立于降糖作用之外的心血管获益。Exendin-4（Ex-4）是一种GLP-1受体激动剂，已有证据表明它可能通过调节线粒体功能发挥心脏保护作用。然而，Ex-4是否能够对抗CP诱导的心脏毒性，以及其具体作用机制是否涉及关键应激通路p53和NF-κB，尚不清楚。为了解决这一问题，来自泰国玛希隆大学的研究团队开展了一项深入研究，其研究成果发表在《European Journal of Pharmacology》上。

为了探究Ex-4的心脏保护作用，研究人员主要采用了以下关键技术方法：使用大鼠H9c2心肌母细胞系作为体外模型；通过MTT法评估细胞活力；利用Seahorse XF分析仪检测线粒体呼吸功能（氧消耗率，OCR）和糖酵解功能（细胞外酸化率，ECAR）；采用MitoSOX Red和DCFH-DA荧光探针分别检测线粒体和细胞内活性氧（ROS）水平；借助结构光照明显微镜（SIM）高分辨率观察线粒体形态；通过Caspase-Glo 3/7试剂盒分析细胞凋亡；使用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定肿瘤坏死因子-α（TNFα）水平；并通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白质印迹（Western blot）技术检测相关基因和蛋白的表达变化。此外，研究还使用了p53通路抑制剂（pifithrin-α, PIFα）和激活剂（nutlin-3, NUT3）以及NF-κB通路抑制剂（JSH-23, JSH）和激活剂（NF-κB activator 1, NA1）进行药理学干预，以阐明信号通路的具体作用。

3.1. Ex-4在恢复CP诱导的心脏毒性中的线粒体呼吸和生物能量学方面的保护作用

研究人员首先确认了Ex-4（最高80 nM）对H9c2细胞无毒性，而CP（10 μM）则显著降低细胞活力。Ex-4预处理能有效拮抗CP的细胞毒性。通过Seahorse能量代谢分析发现，CP暴露严重损害了线粒体呼吸参数，包括基础呼吸、最大呼吸、ATP产量和备用呼吸能力，而Ex-4预处理能显著恢复这些参数。同时，CP降低了糖酵解功能（ECAR、糖酵解能力和糖酵解储备），Ex-4则能改善之。在分子水平上，CP下调了线粒体生物发生关键标志物NRF1、PGC1α和ATP5A的mRNA和蛋白表达，Ex-4处理则逆转了这种下调。这些结果表明，Ex-4通过维持线粒体生物能量学稳态来保护心肌细胞免受CP损伤。

3.2. Ex-4对CP扰乱的线粒体动力学的恢复作用

CP处理显著增加了线粒体和细胞内ROS水平，诱导了氧化应激。Ex-4有效降低了这两种ROS水平。利用高分辨率SIM成像技术观察到，CP引起线粒体显著碎片化（表现为球形形态），而Ex-4处理则促进线粒体融合，形成 elongated, tubular 形态，并部分逆转了CP诱导的碎片化。基因和蛋白表达分析显示，CP下调融合相关基因（OPA1, MFN1），上调裂变相关基因（DNM1, FIS1）；Ex-4则逆转了这一趋势，增加OPA1和MFN1表达，降低DNM1和FIS1表达。Western blot结果进一步证实Ex-4恢复了CP引起的OPA1蛋白下降和DNM1蛋白升高。这表明Ex-4通过调节线粒体融合/裂变平衡来维持线粒体结构完整性。

3.3. Ex-4对CP诱导的心脏细胞凋亡和炎症的保护作用

CP暴露显著增加了caspase-3/7活性，表明凋亡被激活。Ex-4预处理有效抑制了CP诱导的caspase-3/7活性升高。在凋亡调控因子方面，CP降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，增加了促凋亡蛋白BAX的表达，Ex-4则逆转了这些变化，恢复了Bcl-2/BAX平衡。在炎症方面，CP处理提高了TNFα和IL6的mRNA和蛋白水平，而Ex-4预处理显著降低了这些促炎因子的表达。信号通路分析显示，CP增加了p53（Ser15）和NF-κB p65（Ser536）的磷酸化水平，而Ex-4抑制了这种磷酸化激活。此外，CP抑制了促生存信号通路Akt和Erk1/2的磷酸化，Ex-4则恢复并增强了p-Akt和p-Erk1/2的水平。这些结果说明Ex-4通过抑制p53/NF-κB通路和激活Akt/Erk生存信号来拮抗凋亡和炎症。

3.4. p53和NF-κB通路是Ex-4心脏保护作用的关键介质

为了明确p53和NF-κB通路在Ex-4保护机制中的作用，研究人员使用了通路特异性调节剂。结果显示，在CP存在下，同时使用Ex-4和p53抑制剂（PIFα）或NF-κB抑制剂（JSH）能进一步增强细胞活力，更有效地降低ROS水平、caspase-3/7活性和TNFα释放，并更显著地上调线粒体生物发生（NRF1, PGC1α, ATP5A）、融合（OPA1, MFN1）和抗凋亡（Bcl-2）相关基因/蛋白表达，同时下调裂变（DNM1, FIS1）、促凋亡（BAX）和炎症（TNFα, IL6）相关指标。相反，当使用p53激活剂（NUT3）或NF-κB激活剂（NA1）与Ex-4共同处理时，Ex-4的保护作用被削弱甚至逆转，细胞损伤加剧。线粒体功能测定也证实，抑制p53或NF-κB通路能增强Ex-4对CP引起的线粒体呼吸和糖酵解功能障碍的改善作用，而激活这些通路则产生相反效果。补充实验还表明，同时抑制p53和NF-κB通路产生了协同保护效应，而同时激活两者则产生协同损伤效应。这证实了p53和NF-κB通路在Ex-4介导的心脏保护中扮演着关键角色，且两者之间存在相互作用。

本研究系统阐明了Ex-4（一种GLP-1受体激动剂）在对抗顺铂（CP）诱导的H9c2心肌细胞损伤中的保护作用及其分子机制。研究结论表明，Ex-4通过激活GLP-1受体，进而启动下游的Akt和Erk1/2等促生存信号通路，最终抑制了p53和NF-κB这两个关键应激通路的过度激活。这一信号传导过程的核心效应是恢复了线粒体功能稳态：Ex-4改善了线粒体生物能量学（提升OCR和ECAR），重塑了线粒体动力学平衡（促进融合、抑制裂变），从而减少了氧化应激（降低ROS），并最终抑制了由线粒体损伤触发的细胞凋亡和炎症反应。

该研究的深刻意义在于，它不仅揭示了Ex-4作为一种潜在辅助治疗策略，用于预防或减轻化疗相关心脏毒性的可行性，更重要的是详细阐明了其作用机制集中于保护线粒体这一核心细胞器，并通过p53和NF-κB这一对关键的应激感应通路发挥作用。这为GLP-1受体激动剂的“老药新用”提供了坚实的理论依据和实验支持，将GLP-1信号通路、线粒体质量控制和心脏保护有机地联系起来。尽管本研究是在细胞水平完成，其为后续的动物实验和临床转化研究奠定了重要的基础，对于改善接受化疗的癌症患者的心血管健康结局具有积极的潜在价值。未来研究可进一步在更复杂的体内模型和临床样本中验证这些发现，并探索其与其他心脏保护策略的联合应用潜力。