莱茵衣藻蛋白水解物中抗菌肽的发现及其抗沙门氏菌机制研究

本研究针对化学防腐剂和抗生素滥用引发的耐药性及食品安全问题，创新性地从莱茵衣藻蛋白水解物中筛选出具有强效抗菌活性的肽段TC3–10，通过膜破坏（Na+/K+-ATPase活性抑制）和分子对接（靶向LuxS、GyraseA）双重机制证实其作用，为开发新型天然生物防腐剂提供了理论依据和实践路径。

　　

在食品安全和公共卫生领域，抗生素耐药性（AMR）已成为全球十大健康威胁之一，每年导致约70万人死亡，预计到2050年这一数字将攀升至1000万。化学防腐剂如苯甲酸盐、山梨酸盐和亚硝酸盐虽广泛应用，却可能引发过敏反应、致癌副产物和肠道菌群紊乱等健康风险。面对日益严峻的耐药性和食品安全挑战，寻找天然、安全的替代品迫在眉睫。抗菌肽（AMPs）作为先天免疫中广泛存在的小分子多肽，具有广谱抗菌活性、低耐药潜力和环境兼容性等优势，成为极具前景的候选者。微藻作为高效、可持续的抗菌肽资源库，兼具高蛋白产量、低成本大规模培养和最小资源需求的特点。其中，莱茵衣藻因其基因组已测序、遗传工具先进、培养系统可靠，以及快速生长、高蛋白含量和可扩展性等独特优势，被视为发现和开发生物活性肽的理想平台。

为应对上述挑战，研究人员在《Food Chemistry: X》上发表了题为"Bioactive peptides from Chlamydomonas reinhardtii protein hydrolysate: Identification, antimicrobial activity, and mechanism of action"的研究论文。该研究旨在从莱茵衣藻蛋白水解物中鉴定出针对沙门氏菌的抗菌肽，并阐明其作用机制。

研究团队采用了多项关键技术方法。他们通过冻融循环和高压处理从莱茵衣藻粉末中提取蛋白质，随后使用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及其复合酶系进行酶解，并通过超滤获得不同分子量范围的肽段组分（<3 kDa、3–10 kDa、>10 kDa）。抗菌活性通过体外抑制沙门氏菌生长实验进行评估。抗菌机制研究包括使用碘化丙啶（PI）染色和流式细胞术分析膜完整性，测量相对电导率评估离子泄漏，并检测细胞外蛋白质、核酸含量以及碱性磷酸酶（AKP）和Na⁺/K⁺-ATP酶活性。通过反相液相色谱-质谱联用（RPLC-MS）和PEAKS Studio进行肽段鉴定和从头测序。最后，利用生物信息学工具（如PeptideRanker、APD3、ToxinPred）进行计算机模拟分析，并通过分子 docking 研究肽段与沙门氏菌关键蛋白（LuxS, PDB ID: 5v2w; GyraseA C-terminal domain, PDB ID: 5ztj）的相互作用。

3.1. 蛋白质含量和水解度

研究发现，胰凝乳蛋白酶处理组的水解度（DH）最高（72.51%），显著高于胰蛋白酶（67.59%）和复合酶系（64.89%）。在所有酶处理组中，>10 kDa的肽段组分蛋白质含量最高。尽管胰凝乳蛋白酶水解度更高，但复合酶处理的TC3–10组分（3–10 kDa）显示出最强的抗菌活性，表明肽段多样性而非单纯的水解效率对生物活性更为关键。

3.2. 肽段组分的抗菌活性

抗菌活性评估显示，中等分子量（3–10 kDa）的肽段组分，特别是TC3–10，表现出最强的抗菌活性，在0.25–1 mg/mL浓度下抑制率超过45%，且呈剂量依赖性。低分子量（<3 kDa）和高分子量（>10 kDa）组分活性较弱或不稳定。TC3–10被选作后续机制研究的对象。

3.3. 细胞膜完整性

PI染色和流式细胞术分析表明，TC3–10处理导致沙门氏菌膜完整性呈浓度依赖性破坏，在62.5 μg/mL时，近50%的细胞被PI染色。相对电导率测量进一步证实了肽段引起离子泄漏，表明其通过破坏细胞膜发挥抗菌作用。

3.4. 细胞内物质泄漏

研究检测了细胞外蛋白质和核酸含量。TC3–10处理导致沙门氏菌细胞内蛋白质和核酸泄漏显著增加，且在62.5 μg/mL时达到峰值，这进一步支持了肽段通过破坏细胞膜导致胞内物质外泄的机制。

3.5. 细胞代谢酶

TC3–10处理对碱性磷酸酶（AKP）活性影响不显著，但显著降低了Na⁺/K⁺-ATP酶的活性，且呈浓度依赖性。这表明肽段通过破坏膜结合ATP酶的功能，影响了离子转运稳态。

3.6. 肽段序列的计算机模拟分析

从TC3–10组分中鉴定出26条肽段，其PeptideRanker评分均高于0.7，预测具有高生物活性。理化性质分析显示这些肽段具有不同的亲疏水性和Boman指数（结合潜力）。毒性预测表明所有肽段均无毒。分子对接结果显示，肽段EWRPF对目标蛋白5v2w（LuxS）和5ztj（GyraseA C-terminal domain）均表现出高结合亲和力（ITScorePeP分别为-132.4和-133.6），因此被选作结合位点分析的代表。

3.7. 分子对接

分子对接分析揭示了EWRPF与两个靶蛋白（5v2w和5ztj）的多个潜在结合位点和稳定的相互作用。EWRPF与5v2w形成了包括氢键和π-堆积在内的多种相互作用，而与5ztj则形成了更广泛的氢键网络。这表明EWRPF可能通过干扰群体感应（Quorum Sensing）和DNA超螺旋化（DNA supercoiling）等多个细胞内过程发挥抗菌作用。

研究结论与讨论部分指出，这项工作首次系统地提供了莱茵衣藻蛋白水解物中含有针对沙门氏菌具有显著抗菌活性的生物活性肽的证据。最具活性的TC3–10组分表现出膜破坏和细胞内抑制双重作用。分子对接鉴定出EWRPF作为高亲和力的肽段候选者，能够靶向细菌的LuxS和GyraseA蛋白。生化实验与计算机模拟分析的结合是关键创新点，实现了有前景的抗菌肽的高效识别。这些发现凸显了莱茵衣藻作为可持续生物防腐剂新来源的潜力，并为其应用提供了机制基础。未来的研究可集中于通过体外模型验证这些肽段、优化生产策略以及探索制剂方法，以使其能够在食品系统及其他领域得到实际应用。尽管存在一些局限性（如未测定最小抑菌浓度MIC/最小杀菌浓度MBC，水解条件未优化），但本研究为开发基于微藻肽的新型抗菌剂奠定了坚实的基础，对应对抗生素耐药性和提升食品安全具有重要意义。