《Forensic Chemistry》：Exploring the Forensic Skin and ‘Touched’ Bacterial Community through Full-Length and Variable Region Sequencing of the 16S rRNA Gene
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个体特异性皮肤微生物群通过16S rRNA全长测序与接触物短时效传递研究。比较V1-V9与V3-V4测序效果，发现全长测序显著提升种水平分辨率和α多样性。皮肤微生物群β多样性（0.7-0.9）远低于接触物（近1），且支持向量机模型可100%区分个体。高丰度菌属如Staphylococcus、Streptococcus在接触物中富集，显示潜在个体识别标志物。
王双双|宋峰|杨宇飞|刘波|周成业|王传旭|王彦云|罗海波
中国四川省成都市四川大学基础医学与法医学西部学院法医遗传学系
摘要
人体皮肤微生物组对每个人来说都是独特的，人类皮肤与其接触物体之间的微生物交换有助于追踪个体身份。然而，短暂接触物品上的微生物转移和沉积及其在法医学上的应用仍不为人所充分了解。因此，我们模拟了一个嫌疑人短暂握持刀具的情景，通过测序16S rRNA基因的全长区和变异区来研究从手部到接触物体表面的皮肤相关微生物群的转移情况。结果显示，全长16S rRNA基因测序（V1-V9）在皮肤和接触物体微生物组中实现了更高的分类分辨率（物种水平）和更丰富的α多样性，相比仅测序变异区（V3-V4）的方法。皮肤细菌群落的生物多样性高于“被接触”细菌群落，并且每个个体的皮肤与“被接触”细菌群落之间没有显著相似性。个体内部“被接触”细菌群落的β多样性接近1，而个体间的β多样性（范围为0.7至0.9）明显低于皮肤细菌群落间的β多样性。皮肤细菌群落具有个体特异性，使用支持向量机模型，在两个测序数据集中，通过个体特异性扩增子序列变异区分个体的准确率为100%。在高相对丰度的细菌类群（如表皮葡萄球菌、米氏链球菌和血链球菌）中观察到了个体特异性扩增子序列变异，但在“被接触”细菌群落中可检测到的皮肤特异性扩增子序列变异数量较少。只有少量来自皮肤的类群能够在物体上被检测到，且其可检测性无法通过稳定的个体特异性特征来解释。在皮肤和“被接触”细菌群落中共享的扩增子序列变异中鉴定出的主要细菌属和种属于皮肤微生物组中相对丰度较高的类群，如链球菌、葡萄球菌、棒状杆菌、表皮葡萄球菌、米氏链球菌、牛棒状杆菌、血链球菌等。这些高相对丰度的细菌种类既具有个体特异性，又易于转移，且在接触事件中容易沉积，这可能是法医鉴定中的新标志。
引言
人体内含有多种微生物，包括细菌、真菌和病毒等。每个人体内携带的共生微生物细胞数量约为10到100万亿个，生活在人体内的不同微生物种类超过10,000种[1]，[2]。此外，人体内细菌与人体细胞的比例接近1.3[3]，[4]。人类微生物组的基因多样性被认为高于人类基因组。人类微生物群具有部位特异性，对每个人来说都是独特的[2]，[5]。因此，人类微生物组成为法医学中的一个新兴领域。在法医案件中，微量样本中人类DNA含量不足，难以成功进行短串联重复序列（STR）分析是一个巨大挑战，尤其是对于接触证据样本而言。人体皮肤表面寄居着许多微生物，这些微生物能够从皮肤转移到周围环境或接触物体的表面。人类与其周围环境或接触物体之间的这种微生物交换有助于追踪沉积物质的个体，特别是在人类DNA不足或缺失的情况下。先前的研究表明，基于微生物DNA的分型可以帮助识别低生物量样本[6]。与人体长期接触的物品（如键盘、鼠标和手机）已被广泛研究，其中一些研究揭示了皮肤微生物组在识别这些物品所有者方面的潜力[7]，[8]，[9]，[10]。而与法医场景（如犯罪现场）相关的短期接触物品则受到的关注较少。尽管有一些研究探讨了通过短暂接触发生的微生物转移[11]，[12]，[13]，[14]，但短暂接触物品上的微生物转移和沉积仍不为人所充分了解。因此，本研究模拟了一个嫌疑人握持刀具的情景，以研究从手部到接触物体表面的皮肤相关微生物群的转移。
16S核糖体RNA（rRNA）基因是大多数细菌中高度保守的遗传标记，广泛用于细菌鉴定和系统发育分析[15]，[16]。随着测序技术的进步，特别是下一代测序的准确性和成本效益的提高，16S rRNA基因扩增子测序已成为描述细菌群落多样性的常用方法。在16S rRNA基因的九个高变区中，V3-V4区因其深度和分类广度而常被选择[17]，[18]，[19]。最近，第三代测序技术（如Pacific Biosciences (PacBio)和Oxford Nanopore）的出现使得全长16S rRNA基因测序成为可能[20]，[21]。理论上，全长测序可以提供更精细的分类分辨率，有可能实现细菌类群的物种水平鉴定[22]，[23]。然而，在涉及人类皮肤微生物组的法医应用中，全长测序是否比部分区域测序（如V3-V4）具有显著优势仍不清楚。
在这项初步研究中，我们对16S rRNA基因进行了变异区和全长测序，以研究个体手部及其接触物体表面的细菌群落组成。我们的目标是探索人类皮肤微生物组的个体特异性，研究微生物转移和沉积的模式，并最终确定可能作为法医个体鉴定生物标志物的潜在微生物类群。研究工作流程如图1所示。
样本收集和DNA提取
共有12名无关个体（5名男性和7名女性），年龄在20-30岁之间，过去三个月内没有使用过口服或局部抗生素，参与了这项研究。参与者是从实验室研究人员和本科生中随机招募的。未预先评估他们的脱落状态，以反映自然人群的变异性，并符合实际的法医场景。要求参与者避免洗手和使用化学物质
测序和分类组成概述
共收集了79个样本进行测序，其中3个样本（两个皮肤拭子样本和一个物体拭子样本）因定量不足被排除。共有76个样本进行了16S rRNA基因V1-V9（全长）和V3-V4区域的测序。16S rRNA基因V1-V9区域的测序获得了13,179到75,030个高质量读段。这些读段聚类为6,184个扩增子序列变异（ASVs），在属和
结论
本研究通过全长和变异区测序16S rRNA基因，研究了皮肤和接触物体样本上的细菌群落组成。结果显示，全长16S rRNA基因测序（V1-V9）在皮肤和接触物体微生物组中实现了更高的分类分辨率（物种水平）和更丰富的α多样性，相比V3-V4方法。
CRediT作者贡献声明
刘波：方法学、数据管理。杨宇飞：方法学、数据分析、数据管理。宋峰：撰写 – 审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。王双双：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、方法学、数据分析、概念构思。罗海波：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念构思。王彦云：撰写 – 审稿与编辑，
利益冲突声明
作者声明本研究在没有任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。
致谢
本研究由中国国家自然科学基金（NSFC82371897）和四川省自然科学基金（2024NSFSC0529）资助。
