功能化三维支架模拟骨髓微环境实现体外血小板高效生产

本研究针对输血用血小板供应短缺、保质期短等问题，开发了一种模拟骨髓生理微环境的功能化三维支架系统。研究人员通过筛选259种重组跨膜蛋白，发现ACVR1B、CRTAM、MUCEN和BTN1A1能显著提升脐带血或iPSC来源巨核细胞的血小板产量。在胶原和丝素蛋白支架中功能化这些蛋白可使功能性血小板产量提高2倍，为临床级体外血小板生产提供了新策略。

　　

血小板是人体血液中负责凝血和血管修复的重要细胞成分，但临床供应完全依赖志愿者捐献。英国国民医疗服务体系血液与移植部门数据显示，过去十年血小板需求量增加了20%，每年需要28万单位血小板。捐献血小板存在诸多局限：保质期仅5-7天（远低于红细胞的35天），需要HLA配型，存在异体输血反应和病毒/细菌传播风险，这些因素共同制约着脆弱的供应体系。

在这种背景下，利用可再生干细胞来源在体外生产血小板成为极具潜力的替代方案。人多能干细胞来源的巨核细胞（megakaryocyte，MK）已能实现高产量和高纯度培养，理论上可提供按需供应、免疫兼容且生物安全的血小板产品。然而现实很骨感：体外培养的巨核细胞每个只能产生1-100个血小板，而体内每个巨核细胞可产生1000-2000个血小板，存在数量级的差距。

为什么体外血小板生产效率如此低下？研究人员意识到，单纯的物理刺激（如流体剪切力）虽然必要，但不足以完全模拟体内血栓形成（thrombopoiesis）的复杂过程。骨髓微环境中的细胞间相互作用可能才是关键。已有研究表明巨核细胞与内皮细胞等支持细胞的直接接触对血小板生成至关重要，但其中涉及的具体蛋白质和信号通路仍属未知。

为解决这一难题，剑桥大学干细胞研究所的研究团队在《Haematologica》上发表了一项创新性研究。他们开发了一套整合策略，通过在功能性三维支架中模拟骨髓生理微环境，成功将体外血小板产量提高了2倍。

研究人员采用了几个关键技术方法：首先通过蛋白质组学和转录组学分析筛选出286种潜在膜蛋白，并成功表达其中259种重组跨膜蛋白（recombinant transmembrane proteins，recTMP）；随后建立了两套三维支架系统——胶原蛋白支架通过生物素-链霉亲和素系统功能化，丝素蛋白支架则通过β-片层结合肽实现蛋白固定；最后利用灌注式生物反应器模拟体内流动环境，通过流式细胞术和免疫荧光对产生的血小板进行功能验证。研究使用了脐带血来源的巨核细胞（CBMK）和诱导多能干细胞来源的巨核细胞（iPSC-MK）两种模型系统。

重组受体胞外域文库创建促进血小板形成的微环境

研究人员首先验证了不同细胞系对血小板生产的支持作用。与无饲养层对照组相比，内皮细胞系HUVEC和HBMEC能显著提高血小板产量（分别增加1.90倍和1.73倍），而条件培养基无此效果，证实了细胞直接接触的必要性。通过比较支持性与非支持性细胞系的蛋白质组和转录组数据，研究人员筛选出189种在支持性细胞中富集的膜蛋白，同时从血小板蛋白质组数据库中选取了97种可能参与正向反馈调节的蛋白，共计286个候选蛋白。

鉴定增加血小板产量的重组蛋白

成功表达的259种recTMP被固定于链霉亲和素包被的微孔板进行功能筛选。结果显示，对于CBMK，37种recTMP能显著增加血小板产量；对于iPSC-MK，24种recTMP有促进作用。经过验证实验和剂量效应分析，最终确定ACVR1B对CBMK效果最佳（2.03倍增加），而CRTAM、BTN1A1和MUCEN对iPSC-MK有显著促进作用（1.49-1.77倍增加）。这些蛋白还能促进前血小板（proplatelet）形成，表明其作用于血小板生成的关键步骤。

功能化三维支架材料

研究人员选择了两种已被证明能支持体外血小板生产的三维支架材料：胶原蛋白支架和丝素蛋白支架。胶原支架通过生物素-链霉亲和素"三明治"结构进行功能化，而丝素支架则利用特有的β-片层结合肽实现recTMP固定。两种方法均能实现蛋白在支架中的均匀分布。

重组跨膜蛋白提高丝素支架中的功能性血小板产量

在静态培养条件下，功能化胶原支架使ACVR1B组的CBMK血小板产量增加2.47倍，而三种recTMP组合使iPSC-MK产量增加1.48倍。在更接近生理环境的灌注式丝素支架系统中，效果更为显著：ACVR1B使CBMK血小板产量增加1.5倍；而三种recTMP组合使iPSC-MK产量达到惊人的2.5倍增加，相当于每个iPSC-MK产生2个血小板，比现有技术提高了10倍。重要的是，这些体外产生的血小板表达特征性β1-微管蛋白环，能在胶原上正常铺展，功能与外周血血小板相当。

这项研究的意义不仅在于提高了体外血小板产量，更在于其系统性的研究策略。通过无偏见的蛋白质筛选，研究人员发现了多个此前未知的参与血小板生成的蛋白质，如ACVR1B（激活素受体1B）、CRTAM（细胞毒性T淋巴细胞相关抗原）、MUCEN（粘膜内皮细胞特异性蛋白）和BTN1A1（嗜乳脂蛋白1A1）。这些发现为理解骨髓微环境的分子机制提供了新视角。

研究还揭示了不同来源巨核细胞对微环境信号的差异性响应：脐带血来源的巨核细胞（代表确定性造血）与iPSC来源的巨核细胞（代表胚胎性造血）对不同的recTMP有选择性反应，这反映了它们在不同发育阶段和不同生理环境中的适应性特征。

从转化医学角度看，这项技术可将血小板生产成本降低约3倍，对推动体外血小板生产的临床应用具有重要意义。当前体外生产一个血小板单位的成本高达约15万英镑，而捐献血小板单位成本仅271英镑，巨大的成本差距一直是制约该技术临床转化的瓶颈。

更重要的是，这种"微环境重建"策略具有广泛的适用性。它不仅适用于血小板生产，还可推广到其他需要复杂细胞间相互作用的细胞治疗产品生产领域，如器官样（organoid）培养系统。通过解析特定细胞类型的微环境信号，研究人员能够设计更高效、更特异的体外分化系统，为再生医学提供新的技术平台。

该研究通过模拟骨髓微环境的化学信号网络，结合三维支架的物理支持，成功实现了体外血小板生产效能的显著提升，为解决临床血小板供应短缺问题提供了创新性解决方案，同时也为复杂细胞系统的体外重建提供了可借鉴的研究范式。