通过胎盘递送Fc融合FVIII免疫优势域或肽段调控治疗性因子VIII的免疫应答

本研究针对严重血友病A患者对治疗性因子VIII易产生抑制性抗体的临床难题，探索了通过胎盘递送Fc融合的FVIII免疫优势域或肽段以诱导胎儿免疫耐受的新策略。研究发现，全长rFVIIIFc因分子尺寸大和表面正电荷斑块导致胎盘透过性差，未能诱导免疫耐受；而Fc融合的A2/C2结构域及包含7个免疫优势肽的工程化分子能高效透过胎盘，显著降低子代对治疗性FVIII的抗体反应。该研究为开发能主动诱导对蛋白药物持久免疫耐受的工程化分子奠定了基础。

　　

在治疗严重血友病A（Hemophilia A, HA）的道路上，医学界面临着一个棘手的难题：大约30%的患者在接受外源性凝血因子VIII（Factor VIII, FVIII）替代治疗后，其免疫系统会产生针对FVIII的抑制性抗体（inhibitors）。这些抗体如同“药物警察”，中和了输入的治疗性FVIII，使得治疗失效，出血风险大增。目前，唯一能降低抗体水平的策略是免疫耐受诱导（Immune Tolerance Induction, ITI）疗法，即长期、高频率地给患者输注FVIII，试图“说服”免疫系统接受这个外来蛋白。然而，ITI疗法不仅价格昂贵、过程繁琐，而且在20-30%的患者中最终宣告失败。因此，探索能够主动诱导免疫系统对FVIII产生特异性耐受的新方法，成为血友病治疗领域一个亟待突破的方向。

生命的早期阶段，尤其是胎儿期，是免疫系统发育和成熟的关键时期，此时接触抗原更容易诱导免疫耐受而非免疫应答。受此启发，以及母亲体内的保护性抗体（IgG）能够通过胎盘主动转运至胎儿体内的自然现象，科学家们开始思考：能否利用这一天然的“运输通道”，在胎儿期递送特定的抗原，从而在生命早期就“设定”好免疫系统对治疗性蛋白（如FVIII）的耐受状态？此前的研究已经在小鼠模型中证实，给怀孕的血友病A母鼠注射Fc（可结晶片段）融合的FVIII关键免疫优势结构域A2和C2（即A2Fc和C2Fc），可以部分保护其子代在后续接受FVIII治疗时免受抑制性抗体困扰。然而，这种保护并不完全，子代仍会产生临床相关水平的抗体。那么，一个自然而然的问题是：如果递送的是包含所有抗原表位的完整FVIII分子（即rFVIIIFc），是否能够诱导出更强大、更完全的免疫耐受呢？

为了回答这个问题，由Alejandra Reyes-Ruiz、Sandrine Delignat、Aurélien Azam、Victoria Daventure、Leslie Dourthe、Angelina Mimoun、Geneviève McCluskey、Maria T. Georgescu、David Lillicrap、Jordan D. Dimitrov和Sébastien Lacroix-Desmazes组成的研究团队开展了一项深入的研究，其成果发表在《Haematologica》杂志上。他们的目标很明确：评估通过胎盘递送全长rFVIIIFc能否在血友病A小鼠的子代中诱导出对治疗性FVIII的完全免疫耐受，并深入探究影响Fc融合蛋白胎盘转运效率的关键因素，最终为设计更有效的耐受原性分子提供理论依据。

研究人员首先证实，给妊娠第17.5天（E17.5）的血友病A母鼠静脉注射rFVIIIFc后，确实有少量FVIII抗原能够透过胎盘进入胎儿血液循环，且这个过程具有时间、剂量依赖性，并依赖于新生儿Fc受体（FcRn）的功能，因为不含Fc片段的B区缺失FVIII（BDD-FVIII）完全无法透过胎盘。令人欣慰的是，转运过去的FVIII仍保留了促凝血活性，说明其结构完整性在转运过程中得以维持。然而，当研究人员观察这种产前FVIII暴露对子代免疫系统的长期影响时，却得到了令人失望的结果：与注射对照人IgG1的母鼠子代相比，产前接触rFVIIIFc的子代小鼠，在成长后接受FVIII治疗时，产生的抗FVIII IgG和抑制性抗体水平并无显著差异。这意味着，尽管有少量全长FVIII成功递送，但并未能诱导出预期的免疫耐受。与此形成鲜明对比的是，给孕鼠注射Fc融合的A2和C2结构域（A2Fc和C2Fc）混合物，则能显著降低子代对FVIII的免疫反应，重复了之前的研究结果。这表明，耐受诱导的失败并非由于所用人源Fc片段在小鼠体内不兼容。

为什么全长rFVIIIFc效果不佳？研究人员将目光投向了其胎盘转运效率。比较发现，rFVIIIFc进入胎儿血液循环的量（以转运百分比计）远低于其他Fc融合分子，例如，比A2Fc低约57倍，比C2Fc低约360倍，甚至比分子量也相当大的Fc融合因子IX（rFIXFc）还低5倍。这提示，rFVIIIFc本身存在某些特性阻碍了其高效的胎盘转运。

为了探寻原因，研究团队进行了一系列精巧的实验。他们排除了两个可能的干扰因素：一是Fc片段与Fcγ受体（FcγR）的结合（使用不能结合FcγR的突变体rFVIIIFc^N297A证明）；二是FVIII与其伴侣分子血管性血友病因子（von Willebrand Factor, vWF）在母体循环中的结合（使用不能结合vWF的突变体rFVIII^Y1680FFc以及在缺乏vWF的双敲除小鼠中进行实验证明）。这些因素均未显著影响rFVIIIFc的胎盘转运。

活体成像实验提供了更直观的证据：注射后4小时，rFVIIIFc大量滞留在母鼠的肝脏、肾脏和脾脏中，而到达胎盘和胎儿体内的信号非常微弱。相反，C2Fc则能高效地聚集在胎盘并进入胎儿侧。进一步的细胞实验表明，与人胎盘来源的BeWo细胞共孵育后，rFVIIIFc被细胞内吞的效率低于C2Fc，并且被内吞的部分更多地被导向降解途径（溶酶体），而非转运途径。

那么，根本原因是什么？研究人员将焦点集中在了分子的物理化学特性上。他们发现，分子尺寸是一个重要因素，较大的分子通常转运效率较低。然而，比较两个分子量相近但可变区（Fv）静电势不同的单克隆抗体（m66.6和VRC01）时发现，表面带有强正电荷斑块的m66.6其胎盘转运效率显著低于表面电荷相对中性的VRC01。这提示，正电荷斑块会通过与细胞表面成分的非特异性结合或干扰FcRn的循环过程，阻碍分子的转运。对FVIII三维结构表面静电势的分析显示，其轻链（Light Chain, LCh），特别是C1和C2结构域以及部分A3结构域，存在明显的正电荷区域。为了验证这一假设，他们构建了一个突变体rFVIII^C1C2Fc，通过点突变降低了C1/C2区域的正电荷。结果令人振奋：这个突变体的胎盘转运效率比野生型rFVIIIFc提高了8倍！这强有力地证明了FVIII轻链表面的正电荷斑块是限制其胎盘转运的关键因素之一。此外，研究人员还系统评估了各个FVIII结构域（A1, A2, A3C1, C1, C2, LCh）的Fc融合蛋白的转运情况，发现轻链（LChFc）的转运效率虽然比全长rFVIIIFc高，但仍显著低于其他单个结构域，进一步支持了轻链（包含A3, C1, C2）是主要障碍的观点。

既然全长FVIII因转运效率低而无法有效诱导耐受，而A2Fc/C2Fc的组合只能提供部分保护，研究人员又尝试了两种新策略。第一种是给孕鼠注射覆盖FVIII几乎所有主要结构域（A1Fc, A2Fc, A3C1Fc, C1Fc, C2Fc）的混合物，期望能提供更全面的抗原表位以诱导完全耐受。然而，出乎意料的是，这种“全覆盖”策略并未能比对照更好地保护子代。研究人员推测，这可能是因为抗原表位被“稀释”，反而削弱了对关键免疫优势表位的耐受诱导。于是，他们转向了第二种更精准的策略——“免疫聚焦”（immuno-focusing）。他们根据已有文献，合成了两个Fc融合蛋白：iPep-FVIIIFc 1和iPep-FVIIIFc 2，分别携带3个和4个已知的FVIII免疫优势T细胞表位肽段。这些小巧的分子展现了极高的胎盘转运效率（比rFVIIIFc高120-254倍）。更重要的是，当给孕鼠联合注射这两种分子后，其子代在接受FVIII治疗时，抗FVIII IgG和抑制性抗体的水平均显著降低，展现出了良好的耐受诱导效果。

本研究的关键技术方法主要包括：利用血友病A（FVIII exon 16敲除）小鼠及FVIII/vWF双敲除小鼠模型进行体内实验；通过静脉注射给予孕鼠不同Fc融合蛋白，并采用ELISA和功能性凝血实验检测母体及胎儿血浆中的抗原水平和活性；运用活体荧光成像技术追踪分子在母体器官、胎盘及胎儿的分布；利用人胎盘绒毛膜癌细胞系（BeWo）进行细胞水平的胞吞和胞内转运机制研究；通过分子建模分析蛋白质表面静电势；并通过点突变构建功能缺失或获得性突变体以验证特定假设。

结果部分：

1. 给孕鼠注射A2Fc和C2Fc而非全长rFVIIIFc可调节子代对FVIII的免疫反应

研究人员首先验证了rFVIIIFc能够以FcRn依赖的方式，剂量和时间依赖性地从母体转运至胎儿循环，并保持其促凝血活性。然而，这种产前暴露并未能使子代对后续治疗性FVIII产生免疫耐受，其抗体反应与对照组无异。相反，注射A2Fc和C2Fc的混合物则能显著降低子代的抗FVIII免疫反应。

2. rFVIIIFc的低胎盘转运率并非由于结合FcγR或vWF所致

通过使用不能结合FcγR的突变体（rFVIIIFc^N297A, C2Fc^N297A）和不能结合vWF的突变体（rFVIII^Y1680FFc），以及在vWF缺失的小鼠模型中实验，研究人员证实，这两种相互作用并非导致rFVIIIFc胎盘转运差的主要原因。同时，他们确认了FcRn结合对于Fc融合蛋白的胎盘转运至关重要（C2Fc^IHH突变体因不能结合FcRn而无法转运）。

3. rFVIIIFc在母体器官中滞留，仅少量到达并穿过胎盘

活体成像显示，rFVIIIFc主要积聚在母鼠肝脏、肾脏和脾脏，到达胎盘和胎儿的量极少。细胞实验表明，与C2Fc相比，rFVIIIFc被BeWo细胞内吞的效率较低，且被内吞后更多被路由至溶酶体降解。

4. 蛋白尺寸和正静电势对rFVIIIFc低胎盘转运率的贡献

分析表明，分子尺寸是影响转运的一个因素，但并非唯一因素。表面带有强正电荷斑块的抗体（m66.6）其转运效率低于表面电荷相对中性的抗体（VRC01）。对FVIII结构的分析揭示其轻链存在显著正电荷区域。通过突变降低C1/C2区域正电荷的rFVIII^C1C2Fc突变体，其胎盘转运效率显著提高。对不同FVIII结构域Fc融合蛋白的转运比较发现，轻链（LChFc）的转运效率虽高于全长rFVIIIFc，但远低于其他单个结构域。

5. 胎儿期暴露于FVIII衍生的免疫优势肽可降低HA小鼠对FVIII的免疫反应

尽管注射覆盖多个FVIII结构域的Fc融合蛋白混合物未能诱导耐受，但注射包含7个免疫优势T细胞表位的两个Fc融合肽段（iPep-FVIIIFc 1和2）则成功降低了子代对FVIII的免疫反应，且保护效果在多次FVIII挑战后得以维持。

结论与讨论：

本研究表明，虽然全长rFVIIIFc能够以FcRn依赖的方式透过胎盘，但其效率极低，且不足以诱导子代对治疗性FVIII的免疫耐受。这种低效转运主要归因于FVIII分子的大尺寸以及其轻链表面存在的正电荷斑块，这些特性导致其在母体组织中滞留增多，并可能干扰基于FcRn的胞吞转运和循环过程。值得注意的是，Fc片段与FcγR的结合或FVIII与vWF的相互作用并非主要限制因素。

研究的亮点在于，它不仅解释了为什么全长FVIII不是理想的耐受原，更重要的是，它指出了优化方向：通过工程化改造，例如降低FVIII特定区域的正电荷或使用更小的抗原单位，可以显著提高胎盘递送效率。尤为重要的是，研究成功证明了一种“免疫聚焦”策略的有效性——即使用包含关键免疫优势T细胞表位的Fc融合肽段，能够高效转运并有效重编程子代的免疫系统，诱导出针对FVIII的特异性耐受。这种方法避免了使用庞大且复杂的全长蛋白，而是精准地靶向免疫应答的核心环节。

这项研究的意义深远。它首次系统阐明了影响Fc融合治疗蛋白胎盘转运效率的关键结构因素，为设计下一代能够主动诱导免疫耐受的生物制剂提供了重要的理论依据和可行的技术路径。不仅对于解决血友病A治疗中的抑制剂难题具有直接的应用前景，其揭示的“胎盘递送-免疫耐受”原理以及“免疫聚焦”策略，也可能拓展至其他需要诱导免疫耐受的领域，如对其他蛋白药物的免疫反应、自身免疫性疾病甚至过敏症的早期干预。未来，进一步优化这些工程化分子的设计，评估其在更接近人类情况的模型（如携带正常F8基因的携带者母鼠）中的效果，以及探索其诱导耐受的详细细胞和分子机制（如调节性T细胞的诱导），将是推动这一策略走向临床的关键步骤。