综述：类器官培养在营养研究中的应用进展

这篇综述系统阐述了类器官（Organoids）这一前沿技术在营养研究领域的革命性作用。文章重点介绍了肠道类器官（Intestinal Organoids）作为三维（3D）模型，相较于传统二维（2D）细胞培养的显著优势，特别是在模拟肠道复杂结构（如隐窝-绒毛结构）、研究营养吸收（如葡萄糖、脂质、肽类转运）、代谢调控、宿主-微生物组互作以及疾病建模（如2型糖尿病T2D、结直肠癌CRC）等方面的应用。综述还探讨了类器官极性（如apical-in/basolateral-out）调控的重要性、当前技术局限性（如细胞外基质ECM依赖性、批次间变异）及未来发展方向（如合成水凝胶、多器官芯片），为营养科学提供了更接近生理状态的研究平台。

　　

引言：从二维细胞系到类器官培养的营养研究转型

营养研究旨在阐明营养素同化与作用的基本机制，并评估食物和营养素对整体生理和代谢的影响。传统上，二维（2D）细胞系，如Caco-2（结肠腺癌细胞）、HT-29等，被广泛用作体外模型系统来研究营养素与肠道的相互作用、肠道转运和代谢过程以及营养刺激下的肠道激素分泌。然而，这些单层培养系统无法模拟体内环境的复杂性，它们缺乏组织中天然存在的多种细胞类型，并且其表型可能与体内实际情况存在差异。例如，Caco-2细胞中某些肽转运体（PEPT）的表达水平高于人体胃肠道活检组织，且未能表达小肠中甘油三酯合成的主要途径——单酰基甘油酰基转移酶途径。此外，大多数肠上皮样细胞系来源于肿瘤，可能保留了一些肿瘤相关的表型特征。尽管原代肠上皮细胞可以克服这一局限，但其分化潜能差和去分化快的特性限制了其应用。

这些缺点促使研究人员寻求更好的替代方案，特别是能够模拟具有多种细胞类型的复杂肠道上皮结构的类器官系统。类器官是能够模仿器官功能和结构特征的三维（3D）组织结构。与典型的2D单层培养相比，类器官在生理上更接近完整组织。传统的2D细胞培养无法模拟体内环境中典型的细胞信号网络和通讯模式，而类器官培养则为深入理解基础细胞生物学和生理学提供了广阔前景，并成为生物医学研究中优于2D培养的优选模型。

肠道类器官的特征

肠道类器官的发展是营养研究的一个突破。Sato等人于2009年的里程碑研究首次成功建立了3D类器官培养体系，表明含有富含亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体5（Lgr5）的肠道干细胞可以在水凝胶基质中生长成3D肠道类器官。该体系结合了肠道上皮的关键生长需求：1）使用Wnt激动剂R-spondin 1激活Wnt信号以促进隐窝增殖；2）表皮生长因子（EGF）介导的信号以增强肠道增殖；3）使用骨形态发生蛋白（BMP）家族蛋白的拮抗剂Noggin来诱导隐窝数量扩增。

研究表明，在水凝胶基质中培养的隐窝经历数次分裂和出芽事件后，会产生绒毛样上皮结构域。这种隐窝-绒毛样上皮结构域拥有分化的肠道细胞类型，包括潘氏细胞、肠上皮细胞和肠内分泌细胞（EEC）。当类器官被机械分离并重新铺板时，它们与新鲜分离的小肠隐窝高度相似，且没有显著诱导应激相关基因的证据，这强调了类器官作为体外模型的应用潜力。

肠道类器官可以从多能干细胞或组织驻留的成体干细胞衍生而来。精确调控的微环境配合适当的生物工程策略可以引导多能干细胞遵循其自身的遗传密码自我组织成肠道类器官。同样，肠道隐窝可用于从组织驻留的成体干细胞生成类器官培养物。这些含有成熟干细胞的细胞簇被接种到细胞外基质（ECM）中，使其能够三维生长，获得显著的结构复杂性，成为类似于微型器官的微小结构。

类器官极性在营养研究中的重要性

细胞极性，即细胞成分和功能的不对称分布，在肠上皮功能中起着至关重要的作用。当隐窝或类器官在动物来源的ECM（如Matrigel）中生长时，上皮细胞的顶侧（在活体动物中朝向胃肠道管腔）朝向类器官的内部腔面，产生“顶侧向内、基底侧向外”的形态。因此，上皮细胞的刷状缘和顶侧质膜位于类器官的内侧。一个重要早期技术担忧是，刷状缘和顶侧质膜位于类器官内部，其腔面在体外无法直接接触。

然而，Zietek等人使用不同大小的不可吸收荧光标记化合物检查了这些小鼠肠道类器官上皮层的通透性特征。重要的是，他们发现分子量≤4 kDa的化合物（包括葡萄糖、氨基酸、小肽和脂肪酸）能够高度渗透到类器官的腔室内，而大小为40 kDa的化合物则无法进入。这些发现使得科学家们能够考虑使用类器官系统来研究常量营养素消化终产物以及微量营养素（包括维生素和矿物质）的摄取。

在动物来源的水凝胶中生长的类器官的典型极性也引发了一个问题：这些“顶侧向内”的类器官是否能重现活体生物中通常发现的功能性，例如营养吸收和分泌的方向性。为了克服这一潜在的担忧，几个研究小组开发了合成水凝胶系统和标准操作程序来逆转类器官的极性，从而获得顶侧面向外（朝向培养基）的类器官。Co等人建立了一种逆转人上皮类器官极性的方案，可重复性地产生“顶侧向外”的极化。类器官首先在ECM水凝胶中生长，然后小心地从ECM中取出完整的类器官并转移到悬浮培养中。研究表明，由此产生的极性逆转（顶侧向外）的人胃肠道类器官保持并保留了功能性紧密连接和极化分泌。尽管悬浮培养可能不适用于所有不同类型的类器官研究，但这种极性逆转使研究人员能够有效地研究肠道生物学和功能，包括营养/药物吸收和宿主-微生物相互作用。

类器官培养在营养研究中的应用

利用肠道类器官研究营养转运与代谢

使用类器官进行的营养研究主要集中在肠道，因为人们越来越认识到肠道在全身代谢健康和疾病进展中的作用。在一项使用小鼠小肠生成的类器官进行的开创性研究中，Zietek等人通过检查营养转运蛋白的定位，探讨了类器官用于营养转运蛋白研究的潜力。他们证明，胆汁酸受体TGR5、钠-葡萄糖协同转运蛋白1（SGLT1/SLC5A1）和肽转运蛋白1（PEPT1/SLC15A1）定位于成熟小鼠肠道类器官的刷状缘顶侧表面，而葡萄糖转运蛋白2（GLUT2）则位于基底侧表面；因此，类器官中营养受体和转运蛋白的质膜靶向是恰当的。

碳水化合物消化的单糖产物已使用肠道类器官进行了研究。例如，Zietek及其同事使用放射性标记的葡萄糖和果糖研究了人肠道类器官中单糖的摄取。Hasan等人使用从肥胖患者获得的人肠道隐窝衍生类器官，证明与对照肠道类器官相比，其葡萄糖吸收增加，葡萄糖转运蛋白SGLT1和GLUT2水平升高，同时糖异生作用增强。另一项使用人肠道类器官的研究表明，葡萄糖转运蛋白SGLT1和GLUT2的mRNA表达水平在人肠道类器官和人小肠中相似。

肠道类器官也被证明为研究腔内蛋白质消化产生的肽的吸收和代谢提供了一个强大且生理相关的平台。免疫染色和mRNA分析显示，在人诱导多能干细胞（iPSC）衍生的类器官中，PEPT1与Villin一起定位于顶侧表面。Zietek等人还通过人十二指肠类器官中放射性标记的二肽甘氨酰肌氨酸（Gly-Sar）经由PEPT1的摄取证实了这一点。他们进一步利用小鼠肠道类器官证明，胰岛素刺激导致氨基酸掺入细胞蛋白增加，表明类器官中活跃的蛋白质合成和周转与体内生理学相似。

肠道类器官也被用于研究脂质吸收和代谢。Kohan实验室使用小鼠肠道类器官研究膳食脂肪吸收的机制，并表明肠道类器官不仅重现了体内肠道膳食脂肪吸收和合成，而且在载脂蛋白C-III（Apo-CIII）过表达时模拟了肠道特异性分泌更小的乳糜微粒（CM）。在进一步的研究中，Li等人揭示，存在于3D类器官基底侧表面的脂蛋白中的甘油三酯（TG）被转运穿过基底侧膜，在那里它们作为能源支持乳糜微粒的合成和分泌。

与用于研究常量营养素类似，肠道类器官也被用于了解微量营养素和其他膳食化合物如何被吸收、代谢并参与细胞内信号传导。总的来说，这些关于常量营养素和微量营养素的研究强调了肠道类器官作为一种完整的体外研究模型和强大的工具在营养研究中的潜力，它保留了肠道的表型特征和功能特性，从而允许进行更深入的机制研究。

利用肠道类器官研究营养感应和激素分泌

肠道的营养感应和激素分泌能力也使用肠道类器官系统进行了充分研究。直到2010年代末，肠道干细胞在营养感应中的参与尚不清楚。Ferraris及其同事使用小鼠肠道隐窝衍生的类器官，研究了祖干细胞在分化过程中通过果糖挑战（5 mM或10 mM果糖孵育24小时）的营养感应能力。他们发现，果糖感应可能是在肠道干细胞分化开始后、但在吸收谱系和分泌谱系分化之前获得的。他们证明，肠道细胞分化是感知营养信号所必需的，并且类器官中成熟肠上皮细胞和杯状细胞的富集会导致对单糖果糖更强的反应。此外，使用含有比原位更高比例的肠上皮细胞、杯状细胞或潘氏细胞的特殊类器官，Kishida及其同事表明，分泌细胞（包括杯状细胞和潘氏细胞）能够感知果糖，这进一步证明了类器官在推进营养研究的基础细胞和分子方面的用途。

神经元素3（Ngn3）在肠道EECs中高表达，表达Ngn3-增强型绿色荧光蛋白（Ngn3-EGFP）的转基因小鼠模型证明，在源自肠道隐窝的类器官中存在分泌肠促胰岛素胰高血糖素样肽-1（GLP-1）和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（GIP）的EECs。当类器官从小肠的不同节段生成时，观察到GLP-1和GIP的相似表达模式，表明这些体外类器官模型保留了生理特征。证实这些发现的是，转录组分析表明，来自Ngn3-EGFP类器官的EECs中主要分泌激素（不仅包括GLP-1和GIP，还包括ghrelin、secretin和cholecystokinin）的基因表达模式沿小肠纵轴与体内EECs中发现的表达模式相当。

利用类器官研究营养素在发育和肠上皮功能中的作用

矿物质和微量元素对生长和发育很重要。尽管单层2D细胞系过去是研究微量元素的主要模型，但类器官系统在此类研究中的应用正在增加。最近一项使用在锌（Zn）限制条件下培养的小鼠肠道类器官进行的研究显示，与锌充足条件相比存在显著的形态学差异，表现为复杂性显著降低，绒毛/隐窝结构形成减少，并且紧密连接蛋白claudin-3、zonulin-1（紧密连接调节剂）、E-cadherin（细胞粘附蛋白）和vinculin（连接蛋白）的蛋白浓度降低，这表明锌在胃肠道发育和屏障功能中的功能重要性。如果没有3D类器官系统，锌在肠道形态学中的这种新作用可能无法被识别。类似地，其他几种类器官模型，包括源自人多能干细胞的 cerebellar organoids 和 kidney organoids，已被用于研究微量营养素在发育和代谢中的作用。

循环游离脂肪酸的慢性增加似乎与肠上皮分化和功能的失调有关，过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号和改变的胰岛素受体-胰岛素样生长因子1受体-Akt（Insr–Igf1r–Akt）通路与肠道黏膜变化相关。暴露于0.5 mM棕榈酸盐的脂毒性条件48小时的小鼠肠道类器官确实证实，肠上皮细胞和杯状细胞的细胞发育和分化受损。用日落黄（一种食品生产中常用的偶氮染料）处理小鼠肠道类器官后也发现了肠上皮细胞分化的改变。日落黄补充还与内质网应激和氧化应激水平升高相关。因此，通过使用小鼠肠道类器官培养，作者揭示了长期接触此类食品添加剂可能通过引起慢性肠道炎症影响上皮稳态并产生有害影响。

膳食蛋白质在整体肠道功能中起着重要作用。使用小鼠隐窝衍生的类器官评估了氨基酸饥饿对肠道结构和功能的影响。48小时的氨基酸饥饿显著降低了类器官的大小和紧密连接蛋白claudin-3的水平。有趣的是，重新补充氨基酸不仅恢复了类器官大小、隐窝数量和claudin-3蛋白浓度，还增加了mucin-2和chromogranin A的表达。此外，使用仔猪空肠的肠道类器官证明，L-精氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-胱氨酸的氨基酸混合物以及葡萄多酚通过降低低度炎症标志物（如LPS结合蛋白、核因子κB亚基2和NF-κB p65）改善了上皮健康。总的来说，肠道类器官的使用使得对肠道发育和上皮功能的深入研究成为可能，这是传统的单层2D培养无法实现的。

用于研究饮食-微生物组-宿主相互作用的类器官模型

肠道微生物组在整体宿主健康中扮演重要角色，操纵肠道微生物组已被证明具有减少或调节多种健康状况和疾病的巨大潜力。我们摄入的食物是肠道微生物组组成的关键调节因子，研究饮食-微生物组-宿主相互作用对于理解营养素对健康、疾病和未来治疗发展的整体影响非常宝贵。尽管在过去二十年中肠道微生物组是一个非常活跃的研究领域，但由于缺乏良好的体外模型来模拟直接的微生物组-宿主相互作用，研究主要在动物模型中进行。此外，由于污染风险，用肠道微生物群处理体外培养物实际上很困难，这限制了细胞系在微生物组-宿主相互作用研究中的应用。然而，类器官模型具有巨大的潜力来模拟真实场景，即通过将肠道微生物引入类器官的腔室，或可能通过使用上述极性逆转的“顶侧向外”类器官来研究微生物与上皮的直接相互作用。

使用高通量显微注射装置，Williamson等人测试了小鼠肠道类器官显微注射用于研究宿主-微生物相互作用的潜在效用、效率和可重复性。他们发现，引入的微生物含量在4天内得以维持，需氧和厌氧群落的组成没有改变，这支持了类器官在此类研究中的应用。尽管类器官模型中的显微注射存在局限性，包括必要的研究专业知识和需要根据类器官的大小对微生物含量进行标准化，但将微生物注射到肠道类器官的腔室中将使研究界能够更好地理解微生物组-宿主相互作用。

几个研究小组使用了替代方法来研究宿主-微生物组相互作用。当类器官的顶侧被破坏时，解离的细胞可以与微生物相互作用。因此，解离的人类类器官可以作为单层接种到ECM上，并在培养基中用微生物处理，以直接研究微生物组-宿主关联。例如，Hou等人共培养解离的小鼠肠道类器官和固有层淋巴细胞，以确定罗伊氏乳杆菌D8对肠道屏障功能的保护作用。他们证明，在TNF-α处理后，罗伊氏乳杆菌D8增强了类器官的生长，同时保持了类器官的形态。

宿主-微生物组相互作用也通过用微生物组衍生的营养代谢物处理肠道类器官进行了研究。Freire等人使用来自乳糜泻（CD）患者的类器官，证明当暴露于麸质时，CD类器官与对照组类器官在免疫和屏障功能上存在显著差异，CD类器官中促炎环境升高。Freire等人没有在类器官培养物中共培养肠道微生物群，而是使用微生物衍生的食物代谢物处理类器官。有趣的是，用食物代谢物（包括丁酸盐、乳酸盐和多糖A）处理改善了CD类器官培养物的屏障功能和炎症状况，与对照组类器官相比，降低了麸质诱导的细胞因子分泌。

营养素、肠道微生物群和肠道微生物代谢物对于维持健康的肠上皮很重要，并参与调节整体代谢。因此，拥有一个合适的体外模型不仅对于研究饮食-微生物组-宿主相互作用至关重要，而且对于研究此类相互作用在疾病状态中的机制也至关重要。因此，类器官，尤其是“顶侧向外”的肠道类器官，是进行深入复杂研究的理想体外模型，以更好地理解微生物-宿主相互作用的基础科学，为未来治疗方法和饮食建议的开发铺平道路。

类器官培养的当前局限性与未来方向

类器官系统相对于其他研究模型（包括动物模型）具有广泛优势。然而，尽管类器官模型有许多有前景的应用，但一些局限性和挑战仍然阻碍其广泛应用，包括在营养研究中。维持全身稳态和细胞功能需要多个器官和组织的协调，这些器官间通讯的失调导致许多疾病的发病机制。因此，在研究复杂的代谢疾病时，使用多器官类器官模型比使用单组织模型更理想，以重现自然环境和关键参与者。例如，肾素-血管紧张素系统（RAS）的损伤与代谢综合征的进展相关；RAS介导的血压调节通过许多组织控制，包括肾脏、血管系统、膀胱、大脑以及外周组织（如脂肪组织）。因此，血管紧张素原、血管紧张素I和血管紧张素II等RAS组分的分泌取决于多个器官间的相互作用。需要一个多器官类器官模型来更好地理解邻近器官的作用以及脂肪组织RAS在疾病状态中是如何被调节的。使用此类多组织类器官系统的研究正在兴起。改进的工程策略，如使用先进合成基质和材料以及提高自动化程度，可用于减少类器官生成中的变异性。

另一个潜在的挑战和巨大机遇与类器官培养的个性化临床相关性相关。开发能保持与患者表型功能相似性的类器官模型将是一个重要的突破，可用于临床试验中的诊断测试，以及制定个体化的营养和药物治疗方案。

类器官研究的另一个关键限制是，大多数成熟的、商业化的水凝胶（如Matrigel）是动物来源的，并从Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤中纯化而来。这些动物来源的水凝胶的确切成分未定义，并且由数千种未知组分组成。这些肿瘤来源的成分可能通过干扰分子信号和细胞功能影响研究结果，阻碍了基于动物ECM生长的类器官在基础研究中的应用。实际上，类器官功能和形态的变异性（即批次间变异）被认为在某种程度上是由于动物来源水凝胶的未定义组成所致。因此，非常需要替代性的、明确成分的ECM。改进的工程策略，如使用先进的合成基质和材料以及提高自动化程度，可用于减少类器官生成中的变异性。使用此类合成水凝胶也减少了动物产品的使用，这是一个积极的伦理考量。因此，合成水凝胶在未来所有研究学科的类器官模型开发中具有高度潜力，并且应提供来自类器官培养的更稳健和可靠的结果，这些结果可能直接转化为临床研究。

目前有限的成熟度和功能是类器官培养的另一个限制。尽管在类器官培养中已经实现了显著的发展水平和令人印象深刻的生理功能程度，包括乳腺类器官中的乳汁生产、肝脏类器官中的糖原积累和蛋白质表达，以及先进的肠道类器官，但这些类器官系统中还没有一个能够复制具有完全功能的器官。因此，开发能够提供具有一致表型特征（如3D结构、大小和细胞含量）的均质类器官的生产系统是非常需要的。此外，大多数类器官系统缺乏间质室和完全成熟的血管化。因此，可能需要对水凝胶基质和培养基（例如补充必需生长因子）以及新的培养策略进行改进，不仅是为了支持生长和发育，也是为了产生具有完全成熟度和延长寿命的全功能类器官系统。

类器官相对于2D培养的优势在某些情况下也可能成为劣势。3D类器官具有比2D培养细胞更复杂的结构和功能，这给系统评估带来了困难。这些形态学复杂性进一步挑战了体外实验和方案的标准化，包括培养和检测方案以及输出数据分析。此外，类器官研究中的更高通量表型筛选等技术仍处于早期发展阶段。建立先进的技术和方案，包括单细胞分析、先进成像系统、生物工程方法（如器官芯片和高通量表型分析）将允许改进类器官在疾病建模和治疗药物发现中的应用。

通过研究技术的进步，包括改善生长稳健性的细胞表面调整、控制细胞内在特性的基因工程、使用改进的明确水凝胶替代动物来源的水凝胶以改善生长条件和定制、引入形状引导的形态发生以重现器官的原始形状，以及调节类器官极性以研究直接营养-上皮和宿主-微生物相互作用，类器官系统相关的一些局限性很可能被克服。因此，为了获得更真实的结果，应该在类器官研究中开发先进技术以及质量控制系统。

总之，目前各种类器官系统正被广泛用于营养研究，以更好地理解我们所吃食物的影响。正如所讨论的，肠道类器官更好地代表了所研究器官内的生理学和细胞内环境，使类器官成为优于传统单细胞2D单层培养的体外系统。类器官还提供了广泛的应用领域，从基础胃肠道营养研究到营养素生物利用度研究和感官研究。此外，类器官作为一种模型已被证明在临床和基础研究中具有多种应用，并对推进生物学研究做出了实质性贡献。尽管体内实验和动物研究不能完全被类器官培养所取代，但这种新颖的模型系统可用于更好地理解营养素代谢活动的潜在机制及其在疾病中的作用，从而促进未来治疗方法的产生。