综述：食用真菌禾谷镰刀菌：未来食品生产的进展、挑战与工程策略

本综述系统阐述了食用丝状真菌禾谷镰刀菌（Fusarium venenatum）作为下一代未来食品生物制造理想底盘细胞的巨大潜力。文章重点总结了针对该菌株开发的合成生物学工具（如CRISPR/Cas9基因组编辑、中性基因组整合位点、多顺反子基因表达系统）的最新进展，并详细讨论了其在高效合成菌体蛋白（mycoprotein）、高价值蛋白（如乳蛋白、蛋蛋白、甜蛋白）以及酪氨酸衍生天然食品添加剂（如甜菜苷betanin）等方面的底盘工程策略与应用前景。面对全球人口增长、耕地资源紧张及传统农业温室气体排放等挑战，该文为开发安全、高效、可持续的微生物制造（microbial manufacturing）未来食品体系提供了重要的理论依据和技术路线图。

　　

禾谷镰刀菌：未来食品生产的明星底盘

面对205年全球人口预计达到97亿的严峻挑战，传统农业生产模式已接近其可持续利用的阈值。在此背景下，基于微生物底盘和合成生物学技术的微生物制造，成为未来食品生产的一种变革性方法。其中，食用丝状真菌禾谷镰刀菌因其公认的安全性和独特的优势，正成为下一代未来食品生物制造的理想底盘。

合成生物学工具包的武装

要使禾谷镰刀菌成为高效的食物生产“细胞工厂”，强大的遗传操作工具是基础。研究人员已为其量身打造了一系列合成生物学利器。

CRISPR/Cas基因组编辑技术

CRISPR/Cas9系统以其高灵活性和效率成为基因组编辑的利器。然而，在禾谷镰刀菌中，Cas9蛋白表现出明显的毒性，会显著抑制菌株生长。聪明的解决方案是利用来自构巢曲霉的AMA1元件，该元件可在无抗生素选择压力下实现载体100%丢失，从而规避Cas9毒性并产生无转基因的基因编辑菌株。结合挖掘到的高效内源5S rRNA启动子，研究人员成功建立了高效的DNA-free CRISPR/Cas9系统，其单基因和双基因编辑效率分别超过85%和75%。不过，该系统仍面临多基因同步编辑效率低、转化周期较长等挑战。未来，通过使用诱导型启动子控制Cas9表达、对Cas9蛋白进行理性设计以降低毒性，以及采用多种策略（如单个启动子驱动、利用核酶或tRNA序列处理）来表达多个sgRNA，有望实现更高效、更快速的多基因编辑。此外，基于失活Cas9的CRISPRa和CRISPRi技术，为在禾谷镰刀菌中实现基因表达的精准调控提供了可能。

稳定的基因表达平台：中性基因组整合位点

稳定的基因过表达对于重构代谢通路至关重要。与容易丢失的附加体质粒相比，染色体整合能提供更稳定可靠的转基因表达。研究人员通过构建随机GFP表达文库，成功鉴定了两个在禾谷镰刀菌中具有高表达水平的新型中性基因组整合位点。利用CRISPR/Cas9介导的同源重组进行靶基因整合时，这两个位点均表现出100%的整合效率和高度的转基因表达稳定性。这些位点已被成功应用于甜菜苷合成酶基因RUBY和丙酮酸羧化酶基因FvPYC的表达，显著提升了目标产物的合成效率。为了满足更复杂的合成生物学需求，未来需要发现更多高效的中性整合位点。

多基因协同表达策略：多顺反子基因表达系统

在代谢工程中，经常需要协调表达多个基因。对于真核生物而言，开发高效的多顺反子表达系统可以简化遗传构建体，减轻对有限启动子资源的依赖。目前，内部核糖体进入位点（IRESs）和自切割2A肽是两种主要策略。IRESs能够以不依赖5‘端帽子的方式启动翻译，但其序列较长、翻译效率相对较低且活性具有细胞类型依赖性。2A肽则通过核糖体跳过机制实现自我切割，产生独立的蛋白质，其序列短，能更精确地控制蛋白比例，下游基因表达水平更高。研究人员已成功将猪捷申病毒1型的P2A肽应用于禾谷镰刀菌，实现了植物天然产物甜菜苷的从头合成。未来，系统比较不同2A肽在禾谷镰刀菌中的切割效率，并探索其他优化元件，将进一步完善其多基因表达工具包。

高通量筛选技术的挑战与机遇

对于禾谷镰刀菌这类易形成菌丝聚集体的丝状真菌，建立如流式细胞分选和微滴微流控系统等高通量筛选技术面临挑战。但基于原生质体或早期萌发孢子的流式筛选，以及微滴包埋技术的探索，为未来实现其高通量筛选带来了希望。

底盘工程的卓越应用

凭借日益完善的工具包，禾谷镰刀菌在多种未来食品的生产中展现出巨大潜力。

高效合成菌体蛋白

禾谷镰刀菌生产的菌体蛋白被美国FDA认定为“公认安全”，其营养均衡，是肉类的可行替代品。相比动物源肉类，菌体蛋白生产具有土地利用少、温室气体排放低、生产周期短等显著优势。通过底盘工程策略，其合成效率得到了显著提升：通过敲除丙酮酸脱羧酶基因FvPDC6阻断乙醇副产物合成，降低了CO₂释放，提高了碳转化率；通过理性干扰糖异生途径（敲除FvPCK并过表达FvPYC）提高了合成速率；通过敲除几丁质合成酶基因FvChs3或FvChs来简化细胞壁，降低了几丁质含量，显著提高了蛋白质含量和消化率。此外，通过敲除分生孢子形成相关基因FvFLBD和SUMO相关基因FvUBQ14，也成功提高了菌体蛋白产量并改善了其营养价值。未来，引入透明颤菌血红蛋白以增强低氧条件下的摄氧能力，或借鉴植物蛋白体概念在菌体内设计蛋白质储存结构，以及调控碳氮代谢全局调控因子，都是值得探索的进一步提高菌体蛋白产量的策略。

高价值蛋白的细胞工厂

除了菌体蛋白，禾谷镰刀菌还是生产高价值蛋白的理想平台。其卓越的安全性、成熟的遗传操作和发酵系统，使其非常适合生产乳蛋白（如酪蛋白、乳清白蛋白、乳铁蛋白）、蛋蛋白（如卵清蛋白）以及甜味蛋白（如索马甜、巴西甜蛋白）等。利用已构建的可视化多拷贝整合底盘菌株，可以方便地通过CRISPR/Cas9介导的同源重组和GFP介导的快速筛选，获得目标蛋白基因的多拷贝表达菌株，从而大幅提高产量。此外，通过内质网工程（如调控磷脂合成相关基因以扩大内质网容量）和筛选使用高效信号肽，有望进一步突破高价值蛋白合成与分泌的瓶颈。

酪氨酸衍生天然食品添加剂的绿色制造

利用禾谷镰刀菌合成酪氨酸衍生的天然食品添加剂（如甜菜苷、多巴 xanthin、阿魏酸、姜黄素、羟基酪醇等）是一种明智的策略，它能同时解决天然食品添加剂和优质食用蛋白供应不足的双重挑战。研究证实，通过整合4个拷贝的甜菜苷生物合成基因，禾谷镰刀菌实现了目前微生物法生产甜菜苷的最高产量。构建高产工程菌株的关键策略包括：通过强化莽草酸途径、解除酪氨酸反馈抑制、削弱竞争支路来增强前体L-酪氨酸的供应；增加合成途径关键基因的拷贝数；对关键酶进行分子修饰和区室化（如线粒体工程、脂滴工程）以提高酶活并消除酶与底物的区室化障碍；以及利用高效的转运蛋白促进目标产物的跨膜分泌，从而减轻细胞内积累带来的代谢负担和细胞毒性。

结论与展望

禾谷镰刀菌作为未来食品生产的超级微生物底盘，其地位已得到牢固确立。尽管在合成生物学工具开发、底盘工程优化以及多样化产品生产方面取得了显著进展，但仍面临多基因编辑效率、高通量筛选、复杂通路构建等挑战。未来，通过跨学科合作，整合系统生物学、先进发酵技术和食品科学，成功应对这些挑战，不仅将巩固禾谷镰刀菌在可持续食品生物制造中的关键作用，还将为利用微生物底盘满足全球对营养、安全、环境友好型食品日益增长的需求提供一个变革性的蓝图。