可重复使用的模块化组合文库驱动酿酒酵母迭代代谢工程高效生产甜菜红素

本研究针对代谢工程中组合文库构建繁琐且难以重复使用的瓶颈，开发了一种克隆自由的自动化兼容框架，通过模块化组合文库的迭代整合，成功将酿酒酵母的甜菜红素产量提升至217.5 mg/L，为高效细胞工厂开发提供了创新性策略。

　　

微生物细胞工厂在可持续化学生产中扮演着越来越重要的角色，然而复杂的多层次调控网络严重阻碍了高性能菌株的开发。特别是在需要多轮迭代优化的代谢工程过程中，传统组合文库存在显著局限性：它们通常针对特定基因组位点设计，整合后该位点便被占用，使得同一菌株谱系中无法重复使用同一文库进行后续优化。更麻烦的是，现有文库构建过程 labor-intensive（劳动密集型），难以适应自动化流程。这些瓶颈问题使得代谢工程中的组合优化策略难以充分发挥其潜力。

为了突破这些限制，来自丹麦技术大学诺和诺德基金会生物可持续性中心的研究团队在《Metabolic Engineering》上发表了一项创新性研究。他们开发了一个无需克隆、自动化兼容的可重复使用模块化组合文库框架，并通过七轮迭代代谢工程成功将酿酒酵母的甜菜红素产量提高了278 mg/L（ABS₅₃₅ = 17.473），在摇瓶培养中达到217.5 ± 5.3 mg/L的贝塔宁和4.3 ± 0.3 mg/L的异贝塔宁产量。

研究团队采用了几个关键技术方法：首先通过PCR扩增和连接反应生成组合文库DNA，避免了传统克隆步骤；利用酿酒酵母高效的同源重组系统，通过通用的体内组装臂（in vivo assembly arms）实现转录单元在任意基因组位点的可编程整合；使用基于CRISPR-Cas的sgRNA质粒指导文库DNA的基因组整合位点；通过两阶段筛选策略（琼脂平板视觉筛选和深层培养验证）高效筛选高产菌株；应用基因组尺度代谢模型（Yeast8和EcYeast8）预测关键靶点；最后通过长读长测序技术分析整合的文库 cassette。

研究结果方面，团队首先设计了甜菜红素途径组合文库（设计空间：～25,000），包含甜菜红素生物合成途径中的三个关键酶：DOPA-4,5-双加氧酶(DOD)、细胞色素P450单加氧酶(CYP76AD，也称为TYH)和糖基转移酶(GT)，每个酶由三种不同强度的启动子驱动。经过三轮迭代优化，获得了产量约25 mg/L的菌株。

2.3 甜菜红素前体和辅因子文库增强甜菜红素生产

研究发现L-酪氨酸限制生产后，团队开发了前体文库（设计空间：～43,000）和辅因子文库（设计空间：～26,000）。前体文库包含35个预测能增强L-酪氨酸代谢的靶点，辅因子文库包含29个靶点，主要针对CYP76AD及其相关还原酶伴侣提供辅因子。通过两轮前体文库迭代，产量提升至130 mg/L，但出现了甜菜黄素积累问题。随后实施的辅因子文库使产量达到205 mg/L，并成功平衡了细胞色素P450系统。

2.4 成对文库组合进一步改善甜菜红素生产

利用文库的模块化特性，团队组合了"途径和辅因子"文库（设计空间：～218,000）和"途径和前体"文库（设计空间：～274,000），获得了最高产菌株，产量达到278 mg/L。摇瓶验证证实最佳菌株产生217.5 ± 5.3 mg/L贝塔宁。

2.5 测序揭示甜菜素和酵母代谢的新见解

通过测序分析发现：AoTYH（CYP76AD）几乎总是由强pTDH3启动子驱动；细胞色素b₅(CYB5)和HEM2（血红素合成限速酶）在辅因子文库中显著富集；全基因组测序发现了一些非预期整合事件，但这些意外整合反而可能促进了产量提升。

研究结论表明，这种可重复使用的组合文库框架能够有效解决代谢工程中的多轮迭代优化难题。该方法不仅适用于甜菜红素生产，还可扩展到其他色素（如类胡萝卜素或花青素）乃至其他非色素分子的生物合成优化。研究的创新性在于将组合文库从单次使用工具转变为可重复、可扩展的代谢工程平台，大大加速了高性能细胞工厂的开发进程。

讨论部分强调，虽然该方法在色素生产中显示出巨大优势（得益于可视化的筛选表型），但对于非色素分子的生产，需要结合生物传感器、高通量质谱或微流控技术等先进筛选方法。此外，模块化设计允许根据需要灵活调整文库复杂度，使其既适用于早期途径建立阶段，也适用于后期工业化生产优化阶段。这项研究为合成生物学和工业生物技术领域的组合优化提供了强有力的工具和方法学基础。