基于CarR生物传感器的高通量筛选平台推动大肠杆菌高产咖啡酸的系统生物制造

本研究针对咖啡酸(CA)微生物合成中存在的酪氨酸氨裂解酶(TAL)活性低及产物毒性强等关键瓶颈，开发了基于Acetobacterium woodii来源转录因子CarR的对香豆酸(p-CA)生物传感器。通过系统优化构建了动态范围宽、灵敏度高的高通量筛选(HTS)平台，结合荧光激活细胞分选技术成功筛选到催化活性提升6.85倍的FjTALG85S突变体和高耐受性生产菌株，最终在5-L生物反应器中获得9.61 g·L?1的CA产量，为酚酸类化合物的微生物制造提供了强大工具。

　　

咖啡酸(caffeic acid, CA)作为一种具有广泛药理活性的天然酚酸化合物，在制药、食品添加剂和材料领域具有重要应用价值。然而，微生物法生产CA面临两大关键挑战：异源酶酪氨酸氨裂解酶(tyrosine ammonia-lyase, TAL)催化效率低下，以及CA及其前体对香豆酸(p-coumaric acid, p-CA)对微生物宿主产生的强烈细胞毒性。传统的代谢工程策略如"推-拉-阻"方法和模块化途径优化难以突破这些瓶颈，而实验室自适应进化、随机诱变和定向进化等非理性策略又受限于缺乏高效筛选工具。

针对这一难题，天津大学的研究团队在《Metabolic Engineering》发表了创新性研究成果。他们从Acetobacterium woodii中鉴定出一种新型酚酸响应转录因子CarR，并以此为核心构建了p-CA生物传感器驱动的高通量筛选平台。通过启动子工程、表达水平精细调控和结构导向的蛋白质改造，系统优化了生物传感器性能，使其动态范围扩展、背景噪声降低、灵敏度提高。研究人员将优化后的生物传感器与荧光激活细胞分选(FACS)技术相结合，建立了高效的高通量筛选体系。

研究采用的关键技术方法包括：转录因子筛选与表征、蛋白质结构预测与分子对接分析、电泳迁移率变动分析(EMSA)、误差倾向PCR构建突变库、荧光激活细胞分选技术，以及5-L生物反应器发酵优化。所有实验均使用大肠杆菌W3110为宿主菌株。

研究结果方面，在"3.1. CA从头生物合成途径的构建"中，通过筛选不同来源的TAL，发现Flavobacterium johnsoniaeu来源的FjTAL效果最佳，使p-CA产量达到763.56 mg·L^?1。在"3.2. TF CarR调控机制研究"中，阐明了CarR通过抑制-抑制因子模式的双重调控机制，既能负调控car操纵子表达，又能自我抑制其转录。在"3.3. 大肠杆菌中p-CA生物传感器的构建"中，开发的生物传感器对p-CA表现出浓度依赖性响应，最高信号强度达到1407.2 a.u.。在"3.4. p-CA生物传感器性能优化"中，通过启动子截断和组合优化，使信噪比提升至8.7倍。在"3.5. 基于p-CA生物传感器的HTS平台构建与性能评估"中，验证了平台能有效区分不同产量菌株，高产菌株p-CA3富集度达到94.8%。在"3.6. 生物传感器HTS平台在FjTAL定向进化及p-CA高产菌株筛选中的应用"中，获得了活性提高6.85倍的FjTAL^G85S突变体，并筛选出耐受性显著增强的M5菌株。在"3.7. CA生物合成途径的自下而上优化"中，通过强化分支酸途径，使CA产量提升至693.58 mg·L^?1。在"3.8. 补料分批发酵"中，PTS系统完整的CA8菌株在5-L生物反应器中实现了9.61 g·L^?1的CA产量，创下目前最高记录。

研究结论表明，该工作成功建立了基于CarR转录因子的高性能生物传感器筛选平台，有效解决了CA生物合成中的关键瓶颈问题。通过定向进化获得的FjTAL^G85S突变体催化效率显著提升，而筛选得到的高耐受性菌株为高水平CA生产奠定了基础。最终获得的9.61 g·L^?1的CA产量证明了该策略的工业应用潜力。这项研究不仅为CA的微生物高效生产提供了切实可行的解决方案，所开发的生物传感器平台还可广泛应用于其他酚酸类化合物及其衍生物的微生物细胞工厂开发，对推动天然产物的生物制造具有重要意义。