基于Geobacillus stearothermophilus T-6 L-阿拉伯糖诱导系统的Acetivibrio thermocellus高效可控表达工具开发

本刊推荐：为解决嗜热非模式微生物Acetivibrio thermocellus缺乏高效可控诱导表达系统的难题，研究人员开发了基于Geobacillus stearothermophilus T-6的ThermoARAi系统。通过系统优化PabnE启动子和AraR阻遏蛋白表达，实现了175倍动态范围、可忽略本底泄漏的L-阿拉伯糖诱导调控，成功应用于纤维素底物全细胞糖化和PET塑料降解，为嗜热梭菌的代谢工程提供了重要工具。

　　

在微生物合成生物学和代谢工程领域，可诱导遗传操作系统是至关重要的工具。然而，对于非模式微生物，特别是嗜热微生物而言，高效可控的诱导系统却鲜有报道。Acetivibrio thermocellus（原名Clostridium thermocellum）作为一种代表性的嗜热、厌氧、木质纤维素降解细菌，因其独特的代谢途径能将纤维素直接转化为乙醇、氢气等能源化合物，已成为生物精炼领域最具潜力的底盘生物之一。尽管针对A. thermocellus已开发出电转化、质粒表达、Thermotargetron介导的基因靶向以及基于同源重组的无标记基因编辑等多种遗传工具，但高性能的诱导系统研究仍处于起步阶段。

目前报道的用于A. thermocellus的诱导系统存在明显局限。其自身固有的laminaribiose诱导系统动态范围低且诱导不稳定，因为诱导剂laminaribiose能被A. thermocellus快速代谢。而基于嗜热嘌呤核开关的2-氨基嘌呤诱导系统则未经充分表征即直接用于乙醇生产。因此，开发一种具有高宿主正交性、稳定诱导表达、成本低廉的诱导剂、低泄漏和宽动态范围的诱导系统，对于推动A. thermocellus的代谢工程和生物技术应用至关重要。

针对这一需求，发表在《Metabolic Engineering》上的研究论文“A designed hybrid pathway for efficient synthesis of D-pantothenate in E. coli”的标题似乎与内容不符，根据摘要和全文内容，实际研究应为开发一种适用于A. thermocellus的嗜热L-阿拉伯糖诱导系统（ThermoARAi）。研究人员选择L-阿拉伯糖作为诱导剂具有独特优势：它是木质纤维素生物质水解液的主要成分，成本低廉，且不能被A. thermocellus利用，从而可实现稳定诱导。研究团队从生长条件与A. thermocellus相近的Geobacillus stearothermophilus T-6中，选取了其L-阿拉伯聚糖利用途径中的诱导型启动子P_abnE和阻遏蛋白AraR作为核心元件进行系统开发。

为开展研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：利用分子生物学技术构建基于pHKm骨架的诱导表达质粒；通过启动子截断和替换（如使用内源强启动子P_CbpB）对AraR阻遏蛋白的表达进行精细调控；采用嗜热β-葡萄糖醛酸酶（GusB）作为报告基因，并通过热处理消除宿主背景活性，精确评估系统性能；通过RT-qPCR验证转录水平变化；应用反选择标记（tdk/FUDR系统）遗传验证系统的泄漏程度；最后在全细胞水平验证系统应用效果，包括分泌表达β-葡萄糖苷酶（BGL）进行玉米芯残渣糖化，以及分泌表达叶枝堆肥角质酶（LCC）进行无定形PET薄膜降解。

3.1. 嗜热L-阿拉伯糖诱导系统的构建

研究人员首先测试了来自G. stearothermophilus T-6的两个启动子P_araD和P_abnE在A. thermocellus中的诱导表达能力。以嗜热β-半乳糖苷酶（LacZ）为报告基因，发现P_abnE展现出更高的诱导表达水平（2.5 U/mg）和更宽的动态范围（8.1倍），因此被选为后续优化的基础启动子。为消除A. thermocellus自身β-半乳糖苷酶背景活性的干扰，研究转而使用超嗜热古菌Sulfolobus solfataricus来源的β-葡萄糖醛酸酶（GusB）作为报告基因，其背景活性可通过75°C热处理有效消除。初步构建的AraR-P_eGusB系统显示出诱导活性，但存在明显的泄漏表达，表明需要进一步优化以提高严谨性。

3.2. 启动子优化以最小化泄漏

为降低系统的本底泄漏，研究人员对P_abnE启动子的调控元件进行了深入分析和系列截断改造。生物信息学分析发现，除了已报道的-35、-10区和AraO2操作子位点外，P_abnE启动子还存在额外的-35/-10样 motif 以及AraO1和AraO3两个反向重复序列。截断实验表明，AraO1位点对AraR阻遏蛋白的结合至关重要，而-35和-10区是转录活性的关键元件。更重要的是，通过优化控制AraR表达的启动子，将原始的P_araR启动子与A. thermocellus内源强启动子P_CbpB融合（构建AraR_T2P_C-P_eGusB），显著提高了阻遏蛋白的表达水平，从而将系统的动态范围从最初的5.4倍提升至138.6倍，同时泄漏表达降至可忽略不计的水平。利用反选择标记tdk进行的遗传验证进一步证实了该系统极低的泄漏性和严格的调控能力。

3.3. ThermoARAi的最佳诱导条件

研究人员进一步优化了诱导条件。结果表明，GusB活性在L-阿拉伯糖浓度0.1至2 g/L范围内呈正相关，浓度超过2 g/L后达到平台期。时间进程分析显示，诱导6小时（细菌生长高峰期）可获得150（±13）倍的诱导活性，且诱导过程不影响细菌生长速率。因此，确定2-4 g/L L-阿拉伯糖和6小时诱导时间为最佳条件。

3.4. ThermoARAi的诱导剂特异性和各种糖的抑制效应

诱导剂特异性测试显示，只有L-阿拉伯糖能诱导GusB表达（175±13倍激活），D-阿拉伯糖、D-葡萄糖等其他测试糖类均无诱导作用，表明系统具有优异的特异性。当L-阿拉伯糖与其他糖类混合时，仅高浓度（10 g/L）D-甘露糖因抑制细菌生长而显著影响诱导效果。

3.5. L-阿拉伯糖依赖的全细胞纤维素底物糖化

为验证系统在分泌表达中的应用，研究人员构建了ThermoARAi调控的BGL表达菌株（ThermoARAi-BGL）。诱导后，胞外BGL活性达到2.83 U/mg，而未诱导时活性与野生型相当。以预处理玉米芯残渣为底物进行全细胞糖化，发现诱导BGL表达能有效水解产生的纤维二糖，解除其对纤维素酶的反馈抑制，最终使葡萄糖产量从未诱导组的10.9 g/L提高至诱导组的13.4 g/L。在整个10天糖化过程中，L-阿拉伯糖浓度保持稳定，证明其作为诱导剂的持久性。

3.6. L-阿拉伯糖依赖的无定形PET薄膜降解

最后，研究将系统应用于PET降解酶LCC的诱导分泌表达。检测胞外酯解活性发现，LCC表达存在最佳诱导浓度窗口（0.7 g/L L-阿拉伯糖）。在10天的PET降解实验中，该诱导浓度下PET薄膜重量损失最高，达62.9%，并检测到相应的水解产物TPA和MHET的积累。

本研究成功开发了适用于嗜热细菌A. thermocellus的高性能L-阿拉伯糖诱导系统ThermoARAi。该系统核心创新在于通过对异源阻遏蛋白AraR表达水平的精细调控（而非直接改造诱导启动子），实现了低泄漏和高动态范围（175倍）的平衡。其优势显著：诱导剂L-阿拉伯糖成本低、不被宿主代谢、稳定性好；系统具有高度特异性、宿主正交性强、对生长无影响。通过全细胞催化纤维素糖化和PET降解两个应用实例，充分证明了ThermoARAi系统在代谢工程和合成生物学应用中的有效性和实用性。

该研究的成功不仅解决了A. thermocellus遗传操作工具的关键瓶颈，其设计策略（即平衡阻遏蛋白表达以优化异源诱导系统）也为在其他非模式微生物，特别是难以进行遗传操作的梭菌纲（Clostridia）微生物中开发类似工具提供了可借鉴的框架。值得注意的是，A. thermocellus属于Oscillospiraceae科，该科微生物在哺乳动物肠道微生物组中广泛存在。因此，本研究开发的遗传工具未来有望经过适配，应用于肠道Oscillospirales菌群的功能研究和工程改造，为肠道微生物组的靶向干预和功能提升开辟新的可能性。