枯草芽孢杆菌系统代谢工程改造实现神经保护剂CDP-胆碱的高效从头生物合成

《Metabolic Engineering》：Systematic rewiring of Bacillus subtilis for efficient de novo biosynthesis of the neuroprotectant cytidine-5′-diphosphocholine

本研究针对CDP-胆碱工业化生产严重依赖昂贵前体CMP这一核心经济瓶颈，通过系统性代谢工程改造枯草芽孢杆菌，成功构建了从葡萄糖从头高效合成CDP-胆碱的微生物细胞工厂。研究通过引入异源CKI和CCT、优化胆碱摄取（过表达OpuD、删除opcR）、强化CTP供应（过表达pyrGE156K、删除pyrR）及调控中心碳代谢等多模块策略，最终在5L发酵罐中使CDP-胆碱产量达到4.79 g/L，且92.7%产物胞内积累，显著简化了下游纯化工艺。该成果发表于《Metabolic Engineering》，为CDP-胆碱的绿色、经济工业化生产奠定了坚实基础。

　　

随着全球人口老龄化进程加速，阿尔茨海默病、帕金森病、中风等神经系统疾病的发病率持续攀升，对有效神经保护药物的需求日益迫切。胞磷胆碱（CDP-胆碱）作为一种内源性核苷酸衍生物，在修复受损神经细胞膜、促进神经递质乙酰胆碱合成等方面展现出卓越的疗效，已成为临床治疗急慢性脑损伤、认知障碍等多种神经系统疾病的核心药物之一。然而，其广阔的临床应用前景却一直被高昂的生产成本所制约。传统的化学合成法和酶催化法均无法摆脱对关键昂贵前体——胞苷一磷酸（CMP）的依赖，这不仅推高了原料成本，其工艺过程也常伴随有机溶剂污染或酶抑制等问题。即便是在微生物发酵法方面，先前的研究虽在毕赤酵母中实现了较高产量，但依然需要添加外源的CMP和磷酸胆碱，未能从根本上解决成本问题。因此，开发一种不依赖CMP、仅以廉价碳源（如葡萄糖）为起点进行从头生物合成CDP-胆碱的技术，成为打破产业瓶颈、满足临床需求的关键。

为了攻克这一难题，研究人员将目光投向了具有“一般公认安全”（GRAS） status、遗传背景清晰且发酵技术成熟的工业明星微生物——枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。近期，山东理工大学杨少梅等人在《Metabolic Engineering》上发表题为“Systematic rewiring of Bacillus subtilis for efficient de novo biosynthesis of the neuroprotectant cytidine-5′-diphosphocholine”的研究论文，报道了他们如何通过系统性的代谢工程策略，成功将枯草芽孢杆菌改造成为一个高效生产CDP-胆碱的细胞工厂。

本研究主要运用了以下关键技术方法：利用基于同源重组的无标记基因组编辑技术对枯草芽孢杆菌进行多位点基因敲除和异源基因整合；通过定量实时PCR（qRT-PCR）分析关键基因的转录水平；使用高效液相色谱（HPLC）对发酵液中的CDP-胆碱、CMP及胆碱等代谢物进行精确定量；最后在5升规模的分批补料生物反应器中验证工程菌的工业化生产潜力。

3.1. 在枯草芽孢杆菌中建立功能性CDP-胆碱生物合成途径

研究首先为本身不具备CDP-胆碱合成能力的枯草芽孢杆菌设计了一条合成途径。研究人员从酿酒酵母中引入了关键的外源酶——胆碱激酶（CKI）和磷酸胆碱胞苷酰转移酶（CCT），构建了一个由组成型启动子TP2驱动的TP2-CKI-CCT人工操纵子，并将其整合到基因组上的yrpC基因位点，成功构建了基础工程菌株BSC1。发酵实验证实，BSC1能够仅以葡萄糖和氯化胆碱为底物，在24小时内产生689.8 ± 4.6 mg/L的CDP-胆碱，实现了真正的de novo（从头）合成。然而，分析发现高达75.5%的外源胆碱未被利用，表明胆碱的跨膜运输是当前主要的限速步骤。

3.2. 促进胆碱摄取以利于CDP-胆碱合成

3.2.1. 阻断胆碱流向甘氨酸甜菜碱合成

为了将细胞内胆碱更多地导向目标产物，研究人员敲除了负责将胆碱转化为甘氨酸甜菜碱的gbsA-gbsB操纵子，获得菌株BSC2。但此举仅使产量微增2.7%，且引起了短暂的生长延迟，说明此分流途径并非主要限制因素，且甘氨酸甜菜碱的缺失可能影响了菌株的渗透压耐受性。

3.2.2. 过表达异源胆碱转运蛋白

为了直接提升胆碱摄取能力，研究人员尝试了三种转运蛋白：来自酿酒酵母的HNM1、来自大肠杆菌的BetT以及枯草芽孢杆菌自身的OpuD。令人意外的是，虽然过表达BetT的菌株BSC4-2表现出最强的胆碱摄取能力，但其CDP-胆碱产量却急剧下降85.7%，表明过快的底物输入可能造成了代谢失衡，反而抑制了合成。而过表达OpuD或HNM1则能分别将产量提升29.4%和26.8%，说明适度的、平衡的转运增强更为有效。

3.2.3. 通过解除转录抑制精细调控内源转运

鉴于异源转运蛋白表达效果的不确定性，研究人员转向精细调控枯草芽孢杆菌自身高效但受严密调控的胆碱ABC转运系统OpuB和OpuC。通过删除其转录抑制因子基因opcR和gbsR，成功解除了对转运蛋白基因的抑制。qRT-PCR分析证实opuB和opuC操纵子基因转录水平显著上调。相应的工程菌株（BSC5-1, BSC5-2）的胆碱消耗显著加快，CDP-胆碱产量也提升了约26%。这一策略实现了对底物摄取的“微调”，优于“蛮力”的异源过表达。然而，产量提升的同时，胆碱到CDP-胆碱的摩尔转化率却下降了，这强烈暗示另一个关键前体——胞苷三磷酸（CTP）的供应不足已成为新的瓶颈。

3.3. 工程化嘧啶代谢以增强CTP供应

3.3.1. 增强CTP合成

CTP合成酶（PyrG）催化UTP生成CTP，但其活性受CTP的反馒抑制，且其基因表达受严谨调控。研究人员首先尝试过表达一个反馈抑制抗性突变体pyrG^E156K（菌株BSC7），但导致了严重的生长缺陷，产量提升有限（9.4%）。这表明单一的酶过表达可能引起嘧啶代谢失衡。随后，他们删除了嘧啶操纵子的转录抑制因子基因pyrR（菌株BSC8）。此举不仅恢复了菌株生长，还使产量提升了17.5%。qRT-PCR分析显示整个pyr操纵子基因均被协同上调，证明通过解除全局转录抑制来增强UMP（尿苷一磷酸）的de novo合成，进而平衡地提升CTP前体池，是比单纯过表达pyrG更有效的策略。

3.3.2. 减少嘧啶核苷酸消耗

为了保存宝贵的CTP池，研究人员系统性地敲除了多个推测参与嘧啶核苷酸降解的基因，如核苷酸焦磷酸酶基因maf、5′-核苷酸酶基因（yfkN, ycsE等）、嘧啶核苷磷酸化酶基因pdp和胞苷脱氨酶基因cdd。其中，同时敲除pdp和cdd（菌株BSC9-8）效果最佳，使产量进一步提升10.1%，达到1441.4 mg/L。这表明阻断核苷（如胞苷）的降解途径有助于保护用于CDP-胆碱合成的胞苷骨架。

3.4. 精细调控中心碳代谢以支持CDP-胆碱生物合成

CDP-胆碱合成是一个耗能过程，需要充足的三磷酸腺苷（ATP）和代谢前体。研究人员通过敲除可能将碳通量引向非目标方向的基因，试图将碳流导向糖酵解和三羧酸（TCA）循环以产生更多能量和前体。敲除果糖-1,6-二磷酸酶基因fbp、丙酮酸:醌氧化还原酶基因ydaP、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pckA和苹果酸酶基因ytsJ等，均带来了不同程度的产量提升。最优的组合（ΔfbpΔydaPΔytsJ，菌株BSC10-6）使产量达到1640.2 mg/L。但这些改造带来的增益相对有限，表明在成功解决了胆碱摄取和CTP供应两大核心瓶颈后，中心碳代谢并非最主要的限速步骤。

3.5. 通过分批补料发酵展示工业化潜力

最终，对综合性能最优的工程菌株BSC10-6进行了5升规模的分批补料发酵验证。发酵32小时后，CDP-胆碱产量达到4.79 ± 0.24 g/L，单位菌体产率为149.0 ± 5.8 mg/g DCW（细胞干重）。一个极具工业应用价值的发现是，高达92.7%的CDP-胆碱积累在细胞内，这极大地简化了后续的产品分离纯化。代谢物分析显示，发酵过程中始终能检测到微量的胞内CMP积累，这提示在解决了前体供应问题后，核心合成酶（CKI和CCT）的催化效率可能成为下一步优化的关键靶点。

综上所述，该研究通过多模块、系统性的代谢工程策略，成功地将枯草芽孢杆菌改造为能够从廉价葡萄糖高效从头合成高价值神经保护剂CDP-胆碱的强大细胞工厂。这项工作的意义不仅在于创建了一个经济上更具竞争力的CDP-胆碱生物制造平台，彻底摆脱了对昂贵前体CMP的依赖，更在于其展示的理性工程策略：例如，平衡底物摄取优于最大化转运，系统解除前体合成的全局调控优于单一酶的过表达。这些策略为利用枯草芽孢杆菌生产其他复杂天然产物提供了宝贵借鉴。最终工程菌在发酵中展现出的高产率和高胞内积累特性，为其工业化应用描绘了广阔前景。未来的研究可聚焦于对核心合成酶进行蛋白质工程改造以提升催化效率，并进一步优化发酵工艺参数，从而将产量推向新的高度。