中国仓鼠卵巢细胞基因组规模CRISPR缺失筛选揭示编码与非编码基因组的关键功能区

本研究针对哺乳动物基因组中90%未注释"暗物质"区域功能未知的问题，开发了基于配对向导RNA(pgRNA)的CRISPR-Cas9基因组规模缺失筛选平台，在CHO细胞中系统鉴定了427个对细胞存活至关重要的基因组区域，其中61个区域缺乏任何已知基因注释。该研究首次实现了对哺乳动物基因组编码和非编码区域的全面功能筛选，为解析基因组"暗物质"功能提供了新范式。

　　

在生物制药领域，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞作为最重要的重组蛋白生产平台，承担着全球95%以上生物药物的生产任务。然而，尽管CHO细胞已被广泛应用数十年，我们对其基因组功能的认知仍存在巨大空白。传统研究主要聚焦于仅占基因组3%的编码基因，而对占基因组90%以上的非编码区域——包括调控元件、结构区域等所谓"基因组暗物质"——的功能了解甚少。这些未注释区域可能蕴含着调控细胞行为的关键信息，但由于缺乏有效的全基因组研究手段，其功能一直难以系统解析。

随着CRISPR基因编辑技术的出现，科学家们获得了探索基因组功能的新工具。然而，传统的CRISPR筛选主要依赖于引入移码突变来破坏编码基因功能，这种方法对非编码区域效果有限，因为单个碱基的改变可能不会影响非编码区域的功能。为了突破这一限制，研究人员开始开发能够完全删除基因组大片段的方法，从而彻底消除目标区域的所有功能，无论其是否编码蛋白质。

在此背景下，发表在《Metabolic Engineering》上的这项研究开创性地构建了一个基因组规模的CRISPR缺失筛选平台，首次实现了对CHO细胞全基因组的系统性功能筛选。研究人员设计了一种创新的配对向导RNA（pgRNA）策略，能够精确删除长达150kb的基因组片段，从而克服了传统方法对非编码基因组研究的局限性。

研究团队采用了多项关键技术方法：首先开发了基于双启动子系统（hU6/7SK）的pgRNA表达载体，确保了两个向导RNA的高效表达；利用multicrispr软件设计了覆盖14,034个基因组区域的112,272对pgRNA文库，实现了对CHO细胞基因组88%区域的覆盖；通过优化的慢病毒转导系统将文库导入CHO K1细胞，确保每个细胞仅接收一个pgRNA对；采用瞬时转染SpCas9蛋白的策略诱导基因组缺失，并通过21天的负向筛选富集存活细胞；最后通过高通量测序和生物信息学分析鉴定必需基因组区域。

3.1. 优化可扩展的配对向导RNA删除大基因组区域方法

研究人员首先验证了pgRNA策略的有效性，选择了五个非必需基因作为靶点，设计了不同大小的删除片段（15-100kb）。通过比较不同启动子组合（hU6/7SK和hU6/mU6）的效率，最终选定hU6/7SK双启动子系统。实验证明，该策略能够成功实现基因组片段的删除，并通过qRT-PCR验证了靶基因表达的有效降低。

3.2. 构建靶向大基因组片段删除的自定义基因组规模CRISPR文库

研究团队将CHO基因组划分为150kb的窗口区域，在每个窗口的上下游1kb区域内设计pgRNA。通过严格的筛选标准（Doench评分≥0.5、零脱靶效应等），最终获得了包含112,272对pgRNA的文库，覆盖了14,034个基因组区域，为后续的全基因组筛选奠定了基础。

3.3. 建立合理的CHO细胞缺失筛选平台

研究人员优化了文库递送和筛选条件，通过控制转导效率（MOI=0.16）确保大多数细胞仅接收一个pgRNA对。采用两次SpCas9转染策略提高删除效率，并通过21天的长期培养筛选对细胞存活必需的基因组区域。

3.4. 基因组规模缺失筛选揭示必需基因组区域

筛选结果鉴定出427个对CHO细胞存活至关重要的基因组区域，总计64Mb。其中285个区域包含多个基因，81个区域仅包含单个基因，而令人惊讶的是，61个区域（14%）完全缺乏任何基因注释，属于真正的"基因组暗物质"。这些发现表明，基因组中存在着大量目前尚未认知的关键功能区域。

3.5. CHO细胞必需基因组分析

功能富集分析显示，必需区域中的基因主要富集在细胞内蛋白质复合物相关的细胞组分术语中。通过整合RNA-seq数据，研究人员发现61个无注释的必需区域中确实缺乏显著转录活性，而其他366个必需区域则表现出不同的转录活性模式。染色质状态分析进一步揭示了必需区域的表观遗传特征，其中 repressed heterochromatin（H3K9me3标记）和Polycomb repressed state（H3K27me3标记）在必需区域中显著富集。

3.6. 通过个体敲除验证必需性并进行功能评估

为验证筛选结果，研究人员选择了六个代表性区域进行个体验证，包括含编码序列的区域、染色质静止区域以及富含增强子标记但无编码序列的区域。通过流式细胞术检测caspase-3/7活性，发现所有六个区域的删除均诱导了显著的细胞凋亡（29-45%）。进一步的核形态学分析显示，必需区域的删除导致核圆形度显著降低，证实了这些区域对维持细胞正常功能的重要性。

这项研究的讨论部分强调了其在多个方面的重要意义。首先，研究建立的pgRNA筛选平台为哺乳动物基因组功能研究提供了新范式，特别是对于非编码区域的功能解析。传统的移码突变策略在非编码基因组研究中存在固有局限性，而完整的区域删除方法能够彻底消除目标区域的所有功能，无论其作用机制如何。

其次，研究发现仅有2-5%的CHO基因组是细胞存活所必需的，这一比例远低于预期。更重要的是，其中14%的必需区域缺乏任何已知的基因注释，这挑战了我们对基因组功能组成的传统认知。这些"暗物质"区域可能蕴含着尚未发现的调控机制，对理解细胞生物学具有重要意义。

第三，研究揭示的表观遗传特征为解析必需区域的功能提供了线索。特别是那些缺乏转录活性但富含特定染色质状态的区域，可能代表着潜在的调控储备，在特定条件下被激活以维持细胞稳态。

值得注意的是，研究的筛选结果具有细胞类型和培养条件特异性。在CHO K1细胞标准培养条件下鉴定的必需区域组成了核心必需基因组，但在其他细胞系或应激条件下可能有所不同。这为后续研究指明了方向，即需要在不同条件下进行类似筛选，以全面解析基因组的条件必需性。

从生物技术应用视角，该研究为CHO细胞工程化改造提供了重要资源。已知的必需区域信息可以指导基因编辑策略的优化，避免破坏关键基因组区域。同时，鉴定出的非必需区域可能成为安全的外源基因整合位点，有助于提高重组蛋白生产的稳定性和效率。

此外，研究中建立的筛选方法和文库资源具有广泛的适用性。同样的策略可以应用于其他哺乳动物细胞系，解析其基因组的必需组成。文库细胞池还可以用于筛选其他生物过程相关表型，如生长速率、产物分泌等，为细胞工厂的理性设计提供支持。

总之，这项研究不仅提供了CHO基因组功能的系统性认知，更重要的是建立了一个强大的研究平台，为后续的基因组功能解析和细胞工程应用奠定了坚实基础。它展示了现代基因组工具在破解生物学基本问题方面的巨大潜力，同时也为生物技术产业的创新发展提供了新的思路和工具。随着对基因组"暗物质"功能的深入理解，我们有望在细胞工程和合成生物学领域取得新的突破。