综述：海洋细菌Vibrio natriegens作为非常规生物技术宿主的代谢工程进展

这篇综述系统梳理了Vibrio natriegens作为下一代工业生物技术宿主的独特优势，重点介绍了其卓越的生长速率（μ高达1.7 h?1）、广谱底物利用能力、天然感受态特性及成熟的合成生物学工具包（如CRISPR、MuGENT等）。文章详细阐述了该菌在有机酸（如琥珀酸、丙酮酸）、二醇（如2,3-丁二醇）、氨基酸衍生物等生物制造，以及细胞免费蛋白合成（CFPS）、生物修复等领域的应用潜力，特别强调了其耐盐特性在可持续海水发酵中的工业价值。

　　

Abstract

海洋细菌Vibrio natriegens以其惊人的生长速率（在葡萄糖最小培养基中μ达1.5–1.7 h^?1）和卓越的底物利用灵活性，成为替代传统微生物宿主的理想平台。其天然感受态特性（由TfoX调控）与兼容E. coli的遗传工具（如CRISPR-Cas9、GoldenBraid模块化克隆系统）相结合，推动了高效基因组编辑方法（如NT-CRISPR、MuGENT）的发展。基因组尺度代谢模型（GEM）和转录调控网络（iModulons）的建立，为理性代谢工程提供了系统级指导。

1. Introduction

微生物的生长速率（μ）和底物消耗速率（q_S）是影响生物工艺经济性的关键参数。V. natriegens的需氧和厌氧生长性能均显著优于E. coli，例如在葡萄糖最小培养基中其q_S可达3.9 g g_CDW^?1 h^?1。此外，其天然感受态特性为基因操作提供了独特优势，促进了高效工具的开发。

2. Metabolism

V. natriegens是兼性厌氧γ-变形菌，能代谢多种工业相关碳源（如葡萄糖、藻酸盐、木糖等）。¹³C代谢通量分析显示，其葡萄糖代谢主要通过EM途径（80–92%），而磷酸戊糖途径（PPP）通量较低（8–18%），NADPH供应依赖膜结合转氢酶补偿。该菌还具备固氮能力，且氮酶复合体对氧具有较高耐受性。

3. Tools for metabolic engineering

3.1. Genome-scale modeling

已发布的GEM包含1096种代谢物和982个胞内反应，预测生长准确率达83%。转录调控网络分析揭示了自然感受态与应激响应之间的调控关联。

3.2. Cloning

多种转化方法（接合、电转、热激、自然转化）已优化。删除核酸酶基因dns可显著提高质粒转化效率（提升3个数量级）。基于天然感受态的系统（如NC7菌株）支持无标记基因组编辑和自动化操作。

3.3. Genome engineering and adaptive laboratory evolution (ALE)

CRISPR-Cas9反选（NT-CRISPR）、λRED系统及碱基编辑等技术实现了精准基因组修饰。ALE结合快速生长特性，可加速菌株适应性进化（如木糖、藻酸盐利用菌株的选育）。

3.4. Synthetic biology parts and toolkits

模块化克隆系统（如GoldenBraid、MoClo）和Marburg Collection提供了标准化遗传元件库。诱导型启动子（P_tet、P_BAD等）、核糖体结合位点（RBS）及终止子已系统表征，支持可预测的途径优化。

4. Metabolic engineering of V. natriegens

4.1. Chassis strains

已构建多个底盘菌株，如删除前噬菌体区域（Δvnp12）的应激耐受株、整合T7 RNA聚合酶的Vmax?系列蛋白表达株，以及能利用藻酸盐的Vibrio sp. dhg。

4.2. Organic acids

通过删除竞争途径（lldh、pfl等）和表达异源基因，成功实现琥珀酸（60 g L^?1）、丙酮酸（54 g L^?1）、L-乳酸（83 g L^?1）等高产。全细胞催化策略将N-乙酰葡糖胺高效转化为神经氨酸（Neu5Ac，126 g L^?1）。

4.3. Alcohols

2,3-丁二醇（41 g L^?1）和1,3-丙二醇（70 g L^?1）的产量通过途径优化和辅因子工程显著提升。异源代谢途径的导入还支持了异戊醇等高级醇的生产。

4.4. Amino acids and derivatives

利用厌氧静息细胞系统生产L-丙氨酸（17 g L^?1），产量达34 g L^?1 h^?1。酪氨酸酚裂解酶工程菌实现L-多巴（54 g L^?1）的高效合成。

4.5. Pigments and polycyclic compounds

异源表达酪氨酸酶、类胡萝卜素等途径，实现黑色素（7.4 g L^?1）、番茄红素、靛蓝等色素的微生物生产。

4.6. Polymers

天然聚羟基丁酸酯（PHB）合成途径经优化后，产量提升至39 wt%。工程菌还能合成聚(3-羟基丁酸-co-乳酸)共聚物，展示了材料多样性潜力。

5. Protein and peptide production with V. natriegens

5.1. Recombinant production

Vmax?和VnDx菌株适用于难表达蛋白（如膜蛋白NQR、细胞色素c）的生产。分泌标签（OmpA、ssYahJ）和通透化策略（如表达PBP4/5）促进蛋白胞外输送。非天然氨基酸嵌入和同位素标记蛋白产量优于E. coli。

5.2. Cell-free protein synthesis

基于V. natriegens裂解物的CFPS系统凭借高核糖体密度，支持高效蛋白合成。线性DNA模板保护策略（如Tus蛋白结合）提升无质粒表达效率。

6. Utilizing the halotolerance of V. natriegens

6.1. Adaptations to high salt conditions

盐应激下，ectoine和甘氨酸甜菜碱合成途径显著上调。ProU和BCCT转运系统协同维持渗透平衡。NhaC家族Na⁺/H⁺逆向转运体参与离子稳态调控。

6.2. Saltwater fermentations

海水为基础的非灭菌发酵成功用于2,3-丁二醇、PHB等生产，降低了淡水消耗和染菌风险。但噬菌体污染和腐蚀问题需进一步解决。

6.3. V. natriegens in microbial fuel cells

该菌具备胞外电子传递（EET）能力，可直接或通过内源吩嗪类介质转化Cr(VI)为Cr(III)，用于重金属修复和微生物燃料电池（MFC）。

6.4. Bioremediation

工程菌能降解氯吡啶、多溴联苯、PET塑料及多环芳烃等污染物。表面展示PETase/MHETase的菌株可实现塑料生物降解。硒酸盐还原和稀土元素（REE）生物吸附功能进一步拓展了环境应用。

7. Advances in process development

优化培养基渗透压（1–1.5 Osmon kg^?1）和温度（30–37°C）可实现高密度培养（62 g_CDW L^?1）。小型化培养系统（RAMOS、μTOM）支持高通量工艺开发。下游处理中膜污染机制的研究为产业化提供数据支撑。

8. Conclusion

V. natriegens凭借其快速生长、遗传可塑性和环境适应性，已成为生物制造、环境修复和合成生物学研究的重要平台。未来需聚焦规模放大、长期稳定性及调控机制解析，以充分发挥其工业潜力。