利用磷酸化驱动策略改造大肠杆菌实现从D-葡萄糖从头高效合成稀有L-山梨糖

本研究针对稀有L-糖生产成本高、获取难的问题，开发了基于磷酸化/去磷酸化步骤热力学驱动碳通量的大肠杆菌微生物生产平台，成功将廉价丰富的D-葡萄糖转化为稀有L-山梨糖，产量达14.5 g·L?1，并共生产具有健康益处的D-景天庚酮糖，为稀有糖的微生物合成提供了新策略。

　　

在糖类化合物的广阔世界中，单糖根据其空间构型主要分为"D"型和"L"型两种对映体。在自然界中，D-糖广泛存在于各种生物体中，而L-糖则极为稀少，因此被称为"稀有糖"。这些稀有糖由于与生物系统相互作用的独特性，在健康、食品和农作物保护等领域展现出巨大潜力。L-山梨糖就是其中一种备受关注的稀有糖，它不仅是维生素C合成过程中的关键前体，还是一种低热量、中等甜度的食糖替代品——甜度约为蔗糖的60-70%，但热量值仅为蔗糖的25%。然而，稀有糖（包括L-山梨糖）的高成本和有限供应严重制约了对其更深入的研究和应用。

目前L-山梨糖的生产主要依赖酶法转化，这些方法存在副产物形成、工艺步骤分散和底物利用效率低等局限性。传统的氧化还原酶法虽然能够实现D-糖向L-糖的立体特异性转化，但依赖于昂贵的氧化还原辅因子（如NAD(H)），需要精心优化的回收系统，使得工业化生产面临挑战。现有生产工艺通常涉及两个分离的步骤：首先通过微生物或化学氢化将D-葡萄糖/D-果糖转化为D-山梨醇，然后利用另一种微生物（如醋酸杆菌或葡萄糖酸杆菌）将D-山梨醇氧化为L-山梨糖。这种分段式生产流程效率有限，且D-山梨醇与L-山梨糖的结构相似性使得纯化分离困难，进一步增加了生产成本。

面对这些挑战，研究人员开始探索新的生物合成策略。近期，泰勒等人成功在大肠杆菌中实现了从D-葡萄糖生产稀有D-糖D-阿洛酮糖的研究，该策略通过磷酸化和去磷酸化步骤为碳通量提供热力学驱动力，克服了低产率的难题。受此启发，研究团队开始思考：能否将类似的磷酸化驱动策略应用于L-山梨糖的生物合成？这一思路促成了本研究的开展，相关成果发表在《Metabolic Engineering》上。

为了开展这项研究，研究人员主要运用了几项关键技术：通过UniProt数据库进行酶候选物筛选；利用HPLC-MS进行体外酶活性分析；采用CRISPR-Cas9介导的同源重组进行基因组编辑（如基因敲除）；使用高密度发酵策略优化生产条件；通过高效阴离子交换色谱（HPAE）结合脉冲安培检测（PAD）进行糖类定量分析。

3.1. 设计L-山梨糖生产途径

研究人员设计了一条从D-葡萄糖到L-山梨糖的生物合成途径。该途径的核心是利用磷酸化和去磷酸化步骤来热力学驱动碳通量。D-葡萄糖通过磷酸转移酶系统（PTS）或半乳糖质子同向转运蛋白（GalP）与葡萄糖激酶（Glk）系统被磷酸化为葡萄糖-6-磷酸（G6P），随后通过葡萄糖-6-磷酸异构酶（Pgi）转化为果糖-6-磷酸（F6P）。关键步骤在于利用山梨醇-6-磷酸脱氢酶（SorD）将F6P转化为山梨醇-6-磷酸（Sbtl6P），再通过L-山梨糖-1-磷酸还原酶（SorE）将Sbtl6P转化为L-山梨糖-1-磷酸（S1P），最后通过磷酸酶（如YbiV）将S1P去磷酸化生成游离的L-山梨糖。为了最大化碳通量导向L-山梨糖生产，研究人员使用了经过工程化改造的大肠杆菌底盘菌株AL4386，该菌株敲除了多个竞争性途径的关键基因，包括zwf（G6P脱氢酶，防止碳流进入磷酸戊糖途径）、pfkA（磷酸果糖激酶A，防止碳流进入糖酵解）、manA（D-甘露糖-6-磷酸异构酶）、alsE（D-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶）、pgm（磷酸葡萄糖变位酶）和gatZ（C4-差向异构酶）。

3.2. L-山梨糖生产酶候选物的体外分析

研究人员从UniProt数据库中筛选出三个SorD和三个SorE的候选酶进行体外功能验证。所有候选酶的核酸序列都经过大肠杆菌密码子优化。体外酶活实验表明，三个测试的SorD酶（SorD1、SorD2、SorD3）和两个SorE酶（SorE1、SorE3）均能催化目标反应，为后续的体内生产实验提供了可靠的酶元件。

3.3. 建立微生物D-山梨醇生产以鉴定SorD

为了评估不同SorD酶在体内的有效性，研究人员首先构建了仅表达SorD（有或无磷酸酶HxpB）的工程菌。结果表明，单独表达SorD时D-山梨醇产量很低，而共表达SorD和HxpB能显著提高D-山梨醇产量，其中SorD2*（使用天然基因序列的SorD2）和SorD3效果较好，因此被选用于后续的L-山梨糖生产。

3.4. 建立微生物L-山梨糖生产以鉴定SorE

在确认SorD2和SorD3的功能后，研究人员进一步共表达SorE和磷酸酶（最初使用YqaB）以完成从F6P到L-山梨糖的完整途径。测试发现，含有sorD2–sorE1–yqaB组合的菌株L-山梨糖产量相对较高。在发酵过程中，除了目标产物L-山梨糖外，还检测到副产物D-果糖、D-山梨醇和D-景天庚酮糖。这些副产物的形成表明细胞内F6P积累以及碳流泄漏到了竞争性途径中。值得注意的是，D-景天庚酮糖本身也是一种具有潜在健康益处的稀有糖，其与L-山梨糖的共生产可能具有独特的应用价值。

3.5. 使用静止期启动子P_gadB改善L-山梨糖生产

为了优化生产，研究人员将诱导型启动子P_LlacO1替换为静止期诱导型启动子P_gadB。该策略允许细胞在生长阶段将碳流主要用于生物量积累，进入静止期后再启动生产途径的基因表达，从而更有效地将碳流向目标产物。实验证明，使用P_gadB驱动sorD2*–sorE1–yqaB表达的菌株能产生1.60 g·L^?1的L-山梨糖，优于相应的P_LlacO1系统。

3.6. 筛选磷酸酶以提高L-山梨糖产量

为了提高S1P去磷酸化的特异性并减少副产物的形成，研究人员测试了七种不同的HAD（卤酸脱卤酶）样水解酶磷酸酶。结果表明，使用YbiV磷酸酶的菌株效果最佳，L-山梨糖产量达到3.51 g·L^?1，且D-景天庚酮糖产量最低（0.39 g·L^?1）。

3.7. 最小化F6P向磷酸戊糖途径的分流

为了增加用于L-山梨糖合成的F6P库，研究人员敲除了转醛酶基因talA和talB，以减少碳流向磷酸戊糖途径的非氧化分支。然而，敲除talA仅使L-山梨糖产量略有增加，而敲除talB反而降低了产量并增加了副产物，表明在没有更有效的L-山梨糖途径碳利用情况下，单纯增加上游F6P对提高产量作用有限。

3.8. 通过额外表达galP和glk增强葡萄糖摄取

为了在高密度培养条件下最大化碳通量，研究人员额外表达了半乳糖质子同向转运蛋白GalP和葡萄糖激酶Glk，以提供替代的葡萄糖摄取和磷酸化途径。诱导表达galP-glk的菌株在24小时内L-山梨糖产量提高到5.26 g·L^?1，同时副产物产量也有所增加，表明增强葡萄糖输入确实提高了整个途径的通量。

3.9. 高密度条件下的L-山梨糖生产

最终，将表达P_gadB:sorD2*–sorE1–ybiV和P_LlacO1:galP-glk的优化菌株（AL4386背景）进行高密度发酵。在96小时的培养过程中，通过定期补料，该菌株平均生产了14.5 g·L^?1的L-山梨糖，生产率为0.15 g·L^?1·h^?1，得率为24.2%。同时，副产物D-山梨醇和D-景天庚酮糖的最终浓度分别为7.62 g·L^?1和4.01 g·L^?1。

本研究成功构建并优化了一条在大肠杆菌中从丰富廉价的D-葡萄糖高效生产稀有L-山梨糖的新途径。该途径的创新之处在于利用磷酸化/去磷酸化步骤热力学驱动碳通量，并采用静止期诱导表达策略协调细胞生长与产物合成。研究不仅实现了较高的L-山梨糖产量（14.5 g·L^?1），还发现其与另一种稀有糖D-景天庚酮糖共生产，后者因其在调节能量代谢和抑制C6糖吸收方面的潜在健康益处而受到关注。这为开发具有协同健康效应的功能性糖混合物提供了可能。

该研究的意义在于证明微生物生产可以作为稀有L-糖生物合成的通用平台，并提供了一种将丰富的D-糖转化为未被充分探索的L-糖的策略。通过扩大L-糖的可及性，这项研究为深入探索其生物学功能、代谢途径和工业应用铺平了道路。它不仅推进了基础糖代谢研究，也拓宽了微生物生产策略的范围，为稀有糖在食品、健康和医药领域的更广泛应用奠定了坚实基础。未来，通过进一步优化酶活性、磷酸酶特异性以及过程控制，有望实现更高的产量和纯度，推动稀有糖的规模化生产和应用。