谷氨酸棒杆菌代谢工程改造：通过解除途径抑制和增强CoA中间体供应提升植物源对羟基肉桂酸转化合成顺,顺-粘康酸的产量

本研究针对谷氨酸棒杆菌在葡萄糖存在下代谢植物源对羟基肉桂酸合成高价值平台化学品顺,顺-粘康酸效率低下的问题，通过删除局部阻遏蛋白PhdR基因，解除了phd操纵子的碳分解代谢物阻遏效应。工程菌株MA-10实现了对羟基肉桂酸与葡萄糖的协同代谢，使粘康酸产量提升高达98倍，并揭示了芳香化合物降解与中心碳代谢通过乙酰-CoA的紧密偶联，为木质纤维素生物质的高效生物炼制提供了创新策略。

　　

木质纤维素生物质作为一种可再生的原料，为可持续生物化学品的生产带来了巨大希望。其中，对羟基肉桂酸（如对香豆酸、阿魏酸和咖啡酸）是从农业残留物和禾本科植物中提取的关键芳香族砌块，具有重要的利用价值。谷氨酸棒杆菌作为一种成熟的工业微生物，近年来被工程化用于生产顺,顺-粘康酸——一种用于生物基塑料、树脂和特种化学品的高价值平台化学品。然而，与其它芳香族化合物不同，产粘康酸的谷氨酸棒杆菌代谢这些对羟基肉桂酸的效率低下，限制了其生产性能。这背后的机制是什么？如何突破这一瓶颈，实现对羟基肉桂酸的高效转化？这些问题成为本研究关注的焦点。

为了回答这些问题，由Fabia Weiland、Kyoyoung Seo等人组成的研究团队在《Metabolic Engineering》上发表了一项研究。他们发现，对羟基肉桂酸的代谢（由phd操纵子编码）在葡萄糖丰富的条件下受到局部阻遏蛋白PhdR的抑制，而在缺乏葡萄糖时，全局调控因子GlxR会激活该途径。这一发现揭示了碳分解代谢物阻遏是限制高效芳香族化合物利用的关键障碍。

研究人员采用了一系列关键技术方法来解析这一调控机制并构建高性能菌株。他们利用mCherry荧光报告系统定量分析了phd操纵子两个转录单元（P_phdAT和P_phdBCDE）在不同碳源条件下的表达动态，直观地展示了葡萄糖的抑制效应。通过基因编辑技术（使用pClik int sacB等整合载体），他们在先前构建的产粘康酸菌株MA-6A的基础上，删除了phdR基因，构建了新型工程菌株MA-10。为了深入探究菌株的代谢状态，研究团队进行了转录组学分析（使用定制微阵列芯片）和代谢组学分析（特别是利用LC-MS/MS检测细胞内CoA硫酯等中间代谢物）。尤为重要的是，他们设计了巧妙的¹³C同位素标记实验，让菌株MA-10在含有[U-¹³C₆]葡萄糖和天然丰度的对香豆酸的培养基中生长，随后通过GC-MS分析蛋白质氨基酸、脂肪酸、细胞壁糖等生物质组分的同位素标记模式，从而精确追踪了对香豆酸侧链碳原子向中心代谢网络的流向。此外，研究还使用了来自小麦秸秆的真实木质素水解物（Biolignin?，由CIMV公司提供）来验证工程菌株在实际原料转化中的性能。

3.1. 碳分解代谢物阻遏限制了谷氨酸棒杆菌利用对香豆酸、阿魏酸和咖啡酸高效生产MA

研究结果表明，在野生型和MA-6A菌株中，当葡萄糖存在时，对羟基肉桂酸的摄取非常微弱，其同化的碳量低于葡萄糖同化碳量的2.9%。只有在葡萄糖耗尽后，芳香族化合物的消耗才被强烈激活并快速进行。这种序贯的底物利用模式显著限制了MA的生产效率。相比之下，下游代谢中间体如对羟基苯甲酸、香草酸和原儿茶酸则能够与葡萄糖被共同消耗，表明阻遏作用特异性地发生在对羟基肉桂酸代谢的初始步骤。

3.2. 利用荧光报告系统分析葡萄糖介导的对羟基肉桂酸利用调控

通过构建P_phdAT-mCherry和P_phdBCDE-mCherry报告菌株，研究人员实时监测了phd操纵子的表达。发现当培养物中含有对香豆酸和葡萄糖时，在葡萄糖支持的生长阶段，mCherry荧光保持在较低水平，表明两个phd转录单元的表达均被抑制。然而，在葡萄糖耗尽后，荧光信号急剧增加，表明操纵子被去阻遏和激活。P_phdBCDE启动子始终表现出比P_phdAT启动子更强的活性（约3倍），反映了两个转录单元内在的启动子强度差异。

3.3. 细胞内对香豆酰-CoA中间体揭示谷氨酸棒杆菌MA-6A中活跃的phd途径通量

尽管存在葡萄糖抑制，代谢组学分析在MA-6A菌株中检测到了对香豆酰-CoA、3-羟基-对香豆酰-CoA和3-氧代-对香豆酰-CoA等所有关键的CoA中间体，证明phd途径在葡萄糖抑制条件下仍然具有基础活性，只是通量极低。

3.4. PhdR缺失特异性地解除了phd操纵子的调控，使其不受营养状态影响

删除phdR基因构建的MA-10菌株，其转录组分析显示，在仅以葡萄糖为碳源时，所有七个phd基因的表达均被显著上调（log₂倍数变化>4.6），证实PhdR是葡萄糖存在下该途径的主要阻遏蛋白。其中，phdBCDE操纵子的上调幅度（log₂倍数变化6.7-7.9）大于phdAT操纵子（log₂倍数变化4.7-5.4），与报告基因实验观察到的启动子强度差异一致。

3.5. GlxR将对羟基肉桂酸分解代谢整合入碳分解代谢物阻遏网络

通过构建缺失GlxR结合位点的突变启动子报告系统（P_phdAT^mut和P_phdBCDE^mut），研究发现GlxR对于葡萄糖限制条件下激活phdBCDE操纵子至关重要，而对phdAT操纵子则具有适度但可检测的激活作用。这表明phd操纵子被整合进了谷氨酸棒杆菌的碳分解代谢物阻遏网络。

3.6. 谷氨酸棒杆菌MA-10以更高的速率、滴度和产量生产MA

性能评估显示，MA-10菌株能够从培养开始就快速共同消耗葡萄糖和对香豆酸或阿魏酸，并在12小时内将芳香底物化学计量地转化为MA。与MA-6A相比，MA-10在对香豆酸和阿魏酸转化中的MA产量在葡萄糖耗尽时点分别提高了48倍和18倍。

3.7. PhdR缺失提高了底物利用效率，使其适应更高浓度

在提高对羟基肉桂酸浓度（最高至30 mM）的实验中，MA-10菌株表现出显著优于MA-6A的性能，能够完全转化15 mM的对香豆酸或阿魏酸，即使在最高测试浓度下也显示出明显的生物转化迹象。

3.8. PhdR缺失增加了谷氨酸棒杆菌MA-10中芳香族CoA硫酯和乙酰-CoA的可用性

代谢组学分析表明，与MA-6A相比，MA-10菌株中所有芳香族CoA酯的相对丰度增加了约3倍，同时乙酰-CoA水平也呈现3倍的增加，表明对羟基肉桂酸代谢通量的增强显著影响了中心代谢。

3.9. 同位素分析证明在MA-10菌株中苯丙烷侧链衍生的乙酰-CoA碳对中心代谢途径有显著贡献

¹³C标记实验是本研究的一大亮点。结果显示，从对香豆酸侧链衍生的¹²C碳原子广泛地掺入了脂肪酸、2-酮戊二酸衍生的氨基酸（如谷氨酸、脯氨酸、精氨酸）、草酰乙酸衍生的氨基酸以及核苷糖和细胞壁糖中。这强有力地证明了对香豆酸分解代谢通过乙酰-CoA与中心碳代谢（TCA循环、乙醛酸循环、糖异生）发生了深刻的相互作用，为其生长和生物合成提供了碳骨架。

3.10. 无糖条件下从对羟基肉桂酸生产MA

令人惊讶的是，MA-10菌株能够以30 mM对香豆酸作为唯一碳源和能源进行生长并生产MA（24小时积累2.2 mM），细胞浓度增加了50%，证明了完全依赖芳香化合物驱动生长和生产的可行性。

3.11. 从芳香族混合物和秸秆木质素水解物生产MA

MA-10菌株能够高效地共同代谢对香豆酸、阿魏酸及其下游中间体组成的混合芳香物。在使用小麦秸秆木质素碱性水解物的实验中，MA-10成功地将其中的对羟基肉桂酸等芳香化合物转化为MA，且MA产量随水解物添加比例的增加而增加，证实了其处理真实木质纤维素原料的潜力。

3.12. 谷氨酸棒杆菌MA-10的底物范围扩展：对甲氧基肉桂酸的代谢

PhdR的缺失意外地扩展了菌株的底物范围。MA-10获得了代谢肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸和3,4-二甲氧基肉桂酸的能力，将这些底物分别转化为MA、茴香酸和藜芦酸等新的苯甲酸衍生物。这对于转化木质素中结构多样的芳香化合物具有重要意义。

本研究通过精妙的代谢工程策略，成功地解除了谷氨酸棒杆菌代谢对羟基肉桂酸的关键限制。所构建的MA-10菌株不仅大幅提升了顺,顺-粘康酸的产量，更重要的是揭示了芳香化合物降解与中心碳代谢之间通过乙酰-CoA实现的紧密偶联关系。这种“分工协作”的代谢模式，使得菌株能够高效地将芳香碳骨架整合到生物质合成中，甚至实现无糖条件下的生长与生产。此外，工程菌展现出的扩展底物谱系，为转化复杂木质素水解物中结构多样的芳香化合物奠定了基础。这项研究不仅为基于谷氨酸棒杆菌的木质素 valorization 提供了强有力的平台菌株，其揭示的代谢调控原理和碳流重编程策略也为开发更高效的微生物细胞工厂提供了新的思路和深刻见解。未来，通过进一步优化关键单加氧酶步骤的通量、适应工业发酵条件，MA-10菌株有望在可持续生物精炼领域发挥重要作用，推动生物基经济