共表达HAC1P激活未折叠蛋白响应显著提升毕赤酵母中茎菠萝蛋白酶产量

本研究通过共表达未折叠蛋白响应（UPR）调控因子HAC1基因，有效缓解毕赤酵母重组表达茎菠萝蛋白酶（Stem Bromelain）过程中的内质网折叠压力，使酶活提高至54 U/mL（目前文献最高值），为工业化高效生产该多用途蛋白酶提供了创新策略。

　　

菌株与培养基

毕赤酵母（Pichia pastoris）宿主X-33（美国Invitrogen公司）用于表达菠萝蛋白酶。使用毕赤酵母GS115（美国Invitrogen公司）的基因组DNA扩增Hac1基因。大肠杆菌（E. coli）DH5α用于载体扩增和阳性克隆筛选。NEB5α宿主用于构建pGAPαBLHAC克隆。重组大肠杆菌菌株在低盐LB培养基（1% 胰蛋白胨，0.5% 酵母提取物，0.5% NaCl）中培养。毕赤酵母菌株在YPD培养基中培养。

重组毕赤酵母菌株的构建

共选取6个在AOX启动子下表达菠萝蛋白酶的重组克隆和2个在GAP启动子下表达的重组克隆，分别标记为pPICαBL1至pPICαBL6以及pGAPαBL1和pGAPαBL2，进行摇瓶实验。所有AOX启动子表达的克隆酶活相当，平均约为2.0 U/mL。而GAP组成型表达则获得更高酶活，达2.41 U/mL。

讨论

菠萝蛋白酶的不同亚型之间序列相似性达80–95%。每种亚型具有独特的底物识别和切割模式，因而适用于多种工业用途。茎菠萝蛋白酶（碱性菠萝蛋白酶）在其他亚型中尤为独特，因其不易被标准蛋白酶抑制剂（如胱抑素和E?64）抑制。其第68位谷氨酸残基决定了其独特的底物识别和蛋白水解特性。

结论

本研究旨在探讨未折叠蛋白响应（UPR）激活因子Hac1p对毕赤酵母中重组茎菠萝蛋白酶折叠与分泌的影响。共表达HAC1导致关键分子伴侣如Kar2p、PDI和Sec63的上调，表明UPR通路被激活。最终在补料分批发酵中酶活提高了6.5倍。产量提升可归因于UPR介导的蛋白质折叠改善与内质网中聚集体的有效清除。