面向可重复的PETase研究：建立标准化的酶生产与活性比较流程

本文针对PET酶研究中因生产方法不统一导致的活性数据难以比较的问题，推荐一项旨在建立标准化PETase生产与纯化流程的研究。研究人员通过优化表达条件、比较纯化策略，开发了一套可重复的标准化方案，成功应用于五种IsPETase变体的功能表征。该工作为酶法塑料降解领域提供了重要的方法学基础，有助于推动高效PET降解酶的开发与应用。

　　

塑料，尤其是聚乙烯 terephthalate (PET)，因其优异的性能而广泛应用于包装和纺织品，但其在环境中的持久性也带来了严重的污染问题，特别是微塑料对人类健康和生态系统的威胁。传统的机械和化学回收方法存在效率低、易产生二次污染等局限。因此，利用酶（如PETase）进行生物降解，将PET解聚为其单体，进而实现闭环回收，成为一种极具潜力的环保解决方案。然而，该领域的研究面临一个重大挑战：不同实验室采用的PETase生产方法（如表达系统、纯化技术）存在显著差异，这直接导致了酶产量、纯度乃至活性的不一致，使得不同研究团队报道的酶性能数据难以进行直接、有意义的比较。这种“可重复性危机”严重阻碍了高效PET降解酶的筛选、优化和最终的应用进程。

为了应对这一挑战，捷克科学院有机化学与生物化学研究所的Katerina Jiraskova等研究人员在《Protein Expression and Purification》上发表论文，致力于开发一套标准化的PETase生产与纯化流程。他们的核心目标是建立一个统一、可靠的工作流程，以确保不同PETase变体（包括野生型和工程改造型）的生产具有高度的可重复性，从而为酶活性的准确比较奠定方法学基础。

研究人员为开展此项方法学研究，主要应用了以下关键技术：首先，他们利用分子克隆技术构建了五种不同的IsPETase变体（包括野生型、W185A、W159H/S238F、FAST_PETase和HOT_PETase）的表达质粒。其次，他们系统评估了多种大肠杆菌（E. coli）表达菌株和不同培养条件（如温度、诱导时机）对目标蛋白可溶性表达的影响。最后，在蛋白质纯化方面，他们重点比较了固定化金属亲和色谱（IMAC，包括重力流Ni-NTA和?KTA系统下的HisTrap）和尺寸排阻色谱（SEC）等层析技术，以确定获得高纯度、高活性酶制剂的最佳方案。所有纯化后的酶均通过PET粉末降解实验进行活性验证，通过监测240 nm波长下的吸光度变化来评估其水解效率。

3.1. PETase变体选择

研究人员选取了五种特性各异的IsPETase变体作为标准化流程的测试对象。这些变体在突变位点数量与位置、熔解温度（T_m）以及已报道的降解活性方面均存在差异，从而能够全面评估所建立流程对不同类型PETase的适用性。

3.2. 表达条件优化

研究团队首先比较了六种常用的大肠杆菌表达菌株对FAST_PETase可溶性表达的影响。结果表明，在标准诱导条件下（0.5 mM IPTG，20°C过夜培养），各菌株间的蛋白产量和可溶性无显著差异。随后，他们重点优化了在BL21(DE3)和BL21-CodonPlus(DE3)-RIL菌株中的表达条件。通过系统测试不同培养温度（16°C, 25°C, 37°C）和不同诱导时机（OD₆₀₀为0.5或0.9），发现37°C诱导导致目标蛋白主要存在于包涵体（不溶性部分）中，而25°C和16°C则有利于可溶性蛋白的表达，其中在OD₆₀₀为0.9时于25°C诱导并培养16小时可获得最高的可溶性蛋白产量。基于这些结果，研究确定将BL21-CodonPlus(DE3)-RIL作为标准表达菌株，并在OD₆₀₀达到0.9时于20°C进行诱导和过夜培养，作为大规模生产的标准条件。

3.3. 蛋白质纯化

纯化策略是本研究的关键环节。研究人员比较了两种主要的IMAC方法：重力流Ni-NTA柱和?KTA系统下的HisTrap柱。结果表明，Ni-NTA一步纯化即可获得较高纯度的PETase，而HisTrap即使在洗涤缓冲液中优化了咪唑浓度（0, 10, 40 mM），其纯化产物中仍存在较多杂质。无论是通过Ni-NTA还是HisTrap初步纯化，后续增加SEC步骤均能有效去除残留杂质，最终得到纯度相当的蛋白。质谱分析证实，所有纯化后的变体均正确形成了分子内的二硫键，并且N端信号肽均被有效切除，最终蛋白序列与设计一致。

3.4. 活性测定

为了评估纯化方法对酶功能的影响，研究人员测定了不同纯化方案得到的FAST_PETase的PET水解活性。结果显示，仅经过单步IMAC（Ni-NTA或HisTrap）纯化的酶活性显著低于经过IMAC+SEC两步纯化的酶。尽管两步纯化后的最终蛋白纯度相似，但经Ni-NTA+SEC纯化的酶仍显示出略高于HisTrap+SEC纯化酶的活性，表明初始的亲和纯化步骤对最终酶的催化效率存在影响。此外，实验证实透析去除咪唑对酶活性没有影响，简化了流程。最后，应用标准的Ni-NTA+SEC流程纯化所有五种PETase变体，并测试了它们在30°C, 40°C和50°C下的降解活性。结果与各变体的已知热稳定性高度吻合：野生型和W185A突变体在30°C活性最高，高温下活性骤降；W159H/S238F在40°C活性提升，但在50°C无活性；而热稳定性更高的FAST_PETase和HOT_PETase则在40°C和50°C表现出显著且持续的水解能力，其中HOT_PETase在50°C的活性最为突出。这些数据成功地验证了所建立标准化流程的有效性。

本研究的主要结论在于，它明确指出了PETase研究中数据可比性差的一个重要根源——蛋白质生产和纯化流程的不一致。研究人员通过系统的条件优化和比对，成功地开发并验证了一套标准化的表达与纯化方案。该方案强调表达温度等条件对可溶性蛋白产量的关键作用优于菌株选择，并确立了IMAC结合SEC的两步纯化策略对于获得高纯度、高活性酶的必要性。讨论部分进一步阐明了本研究的深远意义：通过提供一个可靠、可重复的方法学基础，该工作有助于减少不同研究间的变异性，使得针对不同工程化PETase变体的性能评估更加准确和可信。这不仅能够加速高性能PET降解酶的筛选与优化进程，也为推动酶法塑料回收从实验室走向实际应用奠定了坚实的技术基础。最终，这项研究为整个酶法塑料降解领域迈向标准化和可重复性研究贡献了重要力量。