综述：草坪草的遗传和基因组资源：现状、应用与前景

本综述系统梳理了草坪草遗传和基因组资源的最新进展，重点阐述了与抗病性（如美元斑病、灰斑病）、非生物胁迫耐受性（如干旱、盐碱、寒冷）以及环境适应性等重要性状相关的基因和通路（如DREB/CBF、ABA、JA信号通路）的研究成果。文章还探讨了基因组编辑技术（如CRISPR/Cas9）在草坪草育种和功能基因组学中的变革性潜力，并对利用基因组工具改善草坪草的未来前景、挑战和发展方向进行了展望。

　　

引言

草坪草是重要的城市作物，是城市景观的关键组成部分，广泛存在于运动场、高尔夫球场、住宅草坪、休闲区、路边和机场跑道。它们不仅具有美学价值，还能帮助控制土壤侵蚀、固碳、散热和稳定地表。在全球范围内，草坪草是具有重要经济价值的特色作物。随着全球城市化进程的加速，用于草坪草景观的面积预计将持续增加。

草坪草是禾本科（Poaceae）的单子叶植物， broadly分为冷季型（C₃）和暖季型（C₄）多年生草类，具有独特的遗传和生理特征。常见的冷季型草坪草包括肯塔基蓝草（Poa pratensis L.）、多年生黑麦草（Lolium perenne L.）、高羊茅（Festuca arundinacea Schreb.）等，通常比暖季型物种具有更优的草坪质量和更强的耐荫性。然而，冷季型草坪草的蒸发蒸腾速率和需水量较高，对高温（>30°C）的敏感性通常限制了它们在较暖气候下的表现。相反，暖季型草坪草物种，如狗牙根（Cynodon dactylon (L.) Pers.）、结缕草（Zoysia spp.）等，具有更高的水分利用效率以及耐热和耐旱性。

目前，常见草坪草物种的草坪质量在颜色、分蘖密度、叶片大小和均一性方面已接近最佳改良水平，进一步取得显著进展具有挑战性。因此，草坪草育种家最近开始专注于增强功能性和可持续性，以减少投入需求。然而，增强一个表型性状可能会以损害其他功能性状为代价，例如胁迫耐受性、资源利用效率、抗病性和竞争能力。因此，任何这些性状之间的权衡都对草坪草育种提出了挑战，需要对这些性状进行深入的分子表征以应对这些挑战。

遗传和基因组资源

草坪草分子标记的开发与利用

分子标记对于评估遗传多样性、基因作图和参与分子辅助育种是必需的。在高通量DNA测序出现之前，基于DNA的单基因座标记分析被广泛用于分子育种中的标记辅助选择（MAS）。限制性片段长度多态性（RFLP）标记是首批用于探究各种草坪草遗传多样性程度和构建遗传连锁图谱的分子工具。随机扩增多态性DNA（RFLP）标记也被用于评估肯塔基蓝草和野牛的遗传多样性。扩增片段长度多态性（AFLP）标记部分解决了这些局限性，并使得在多年生黑麦草、多花黑麦草和结缕草中构建连锁图谱成为可能。简单序列重复（SSR）标记的采用提高了遗传图谱的分辨率，特别是在多年生黑麦草的抗冠锈病性状以及肯塔基蓝草品种鉴定方面。多样性阵列技术（DArT）标记改善了中高通量基因分型工作。表达序列标签（EST）衍生的标记可能提供基因与表型变异之间更直接的联系。

分子标记还显著提高了草坪草物种的分类分辨率。例如，AFLP标记已成功用于区分暖季型草坪草。此外，结合AFLP、RAPD和SSR标记的综合系统发育分析揭示了广泛的C₃和C₄草坪草物种的遗传多样性程度并阐明了基因组关系。

高通量测序技术和参考基因组的发展通过高通量基因分型同时检测数百万个单核苷酸多态性（SNP），改变了标记发现。基因分型测序（GBS）和限制性位点关联DNA测序（RAD-seq）等技术已应用于多年生黑麦草、多花黑麦草、结缕草、圣奥古斯丁草和狗牙根。这些高密度SNP数据集促进了数量性状位点（QTL）的定位，用于诸如抗病性、种子脱落和自交亲和性等性状。

基因组测序与组装

基因组序列携带基础的分子信息，可以显著推进基础和应用研究。然而，由于草坪草物种的杂合和多倍体基因组，对其基因组的研究相对有限。尽管如此，最近的技术进步以及长读长测序、光学图谱和利用染色质构象捕获（Hi-C）数据进行支架的应用，支持了为几种草坪草物种组装参考基因组的尝试。

一年生早熟禾（Poa annua L.）的基因组组装揭示了结构重排和转座元件大规模消除的普遍性。肯塔基蓝草（P. pratensis）的基因组组装偶然获得，其大小约为6.09 Gb，大于其他草坪草基因组。早期的多年生黑麦草基因组组装是通过与相关谷物的同线性关系指导的，而后期的组装则是通过涉及PacBio长读长、BioNano光学图谱和Hi-C支架的综合策略产生的。对于多花黑麦草，报道了染色体水平的组装，随后在异源多倍体背景下进行了单倍型解析的组装。在狗牙根中，单倍型解析的组装揭示了对多倍体基因组稳定性和匍匐生长的见解。结缕草、假俭草和海滨雀稗的基因组组装也已被生产出来，促进了与分枝、胁迫耐受性和农艺重要性状相关的基因的更深层次功能比较。

基于转录组的草坪草农艺和胁迫耐受性状见解

转录组深度测序（RNA-seq）已广泛应用于各种草坪草物种，以识别与非生物胁迫相关的潜在基因。耐寒肯塔基蓝草品种的转录组分析揭示了冷胁迫下植物中涉及“淀粉和蔗糖代谢”、“内质网中的蛋白质加工”和“苯丙氨酸代谢”等过程的基因富集。结缕草在寒冷环境中会发生叶片失绿，但用乙烯利处理可通过增强叶绿素生物合成基因的表达并抑制叶绿素降解酶编码基因的表达来帮助维持叶绿素水平。在结缕草中，短期和长期冷处理鉴定出数百至数千个差异表达基因。功能注释表明，这些冷响应基因参与脱水和氧化应激反应、赤霉素和脱落酸信号传导以及光合作用的抑制。

耐旱肯塔基蓝草品系显示出更高的响应脱落酸基因的表达。多年生黑麦草在叶片中光合作用基因下调，以及在干旱后期阶段根细胞转录组发生显著变化。多花黑麦草的转录组分析揭示了响应干旱的碳水化合物/脂质代谢和抗氧化防御相关基因表达的改变。高羊茅植物在干旱胁迫下冠部组织的差异表达基因与光合作用或碳水化合物代谢相关。匍匐翦股颖响应热和干旱表现出共享的转录组变化，涉及脂氧合素生物合成和脯氨酸介导的渗透保护相关基因。海滨雀稗利用根衍生的H₂O₂通过维持茉莉酸水平和Na⁺/K⁺比率来缓解盐度诱导的水分亏缺。

类似的比较转录组研究揭示了耐盐和敏感草坪草基因型背后的盐胁迫响应机制。耐盐肯塔基蓝草种质在盐胁迫下显示的差异表达基因少于盐敏感种质，表明依赖于离子转运和氧化还原途径相关基因的组成型表达。耐盐多花黑麦草基因型通过WRKY、乙烯响应因子和MYB家族的转录因子激活植物激素信号基因和膜转运蛋白基因的表达。用外源24-表油菜素内酯处理的高羊茅表现出改善的耐盐性。

高温会加速冷季型草的夏季衰退，其特征是生长减少、叶绿素损失、叶片衰老和整体草坪质量下降，促使了对耐热性状的研究。耐热肯塔基蓝草的转录组显示热休克蛋白和热休克转录因子基因与热敏感肯塔基蓝草相比上调，表明伴侣系统是承受高温的关键。

草坪草病害显著降低植物健康、持久性和整体可持续性。因此，全面了解草坪草抗病性的分子和生理机制对于开发能够在外来攻击后持续生存的抗性品种至关重要。真菌内生菌因其增强胁迫恢复力、抗虫性和整体草坪草活力的能力而受到关注。例如，高羊茅相关的内生真菌主要通过刺激植物内源脱落酸生物合成来改善宿主耐旱性。

此外，转录组研究为草坪草的关键形态和生殖性状提供了见解。根茎形成在肯塔基蓝草中受MYB、NAC和C2H2转录因子调控。在高羊茅中，异构体测序鉴定出负向调控分蘖的候选基因。类似地，高分蘖突变体的比较转录组分析确定了相互作用调节分蘖出现的基因。两个狗牙根品种的比较转录组研究表明，它们在木质素生物合成、淀粉分配和糖酵解相关酶编码基因的表达上存在差异。

草坪草的遗传工程与生物技术

遗传转化

稳定的组织培养系统和高效的转化方案对于草坪草中的基因功能研究和基因组编辑至关重要。由于种子育性低和杂合度高，通常优选从匍匐茎节或幼嫩花序衍生的胚性愈伤组织来产生转基因系。在过去的三十年里，草坪草物种中已经建立了各种细胞、组织和器官培养系统。通常使用外植体如成熟种子、幼嫩花序和匍匐茎节进行愈伤组织诱导。

转基因草坪草品系通常使用基因枪法或根癌农杆菌介导的转化来开发。基因枪法将DNA包被的金属颗粒递送到分裂细胞中。由于转基因拷贝数较低且世代间表达更稳定，根癌农杆菌介导的转化通常是首选。这两种方法都已应用于狗牙根。圣奥古斯丁草通过重复粒子轰击进行了遗传修饰，产生了商业品种ProVista?。

根癌农杆菌介导的转化将T-DNA整合到基因组中，与粒子轰击等方法相比具有更高的转基因产量。尽管单子叶植物通常被认为对根癌农杆菌具有抗性，但该方法转化已在许多禾本科物种中成功报道。然而，与其他禾本科物种相比，草坪草中通过根癌农杆菌介导转化产生的转基因系非常少。为了克服低转化效率，研究人员专注于优化影响转化结果的因素。

原生质体介导的转化在各种植物物种的遗传工程中发挥了关键作用。在这些系统中，细胞壁的去除允许通过聚乙二醇或电穿孔直接摄取外源DNA，然后选择性再生转基因细胞成完整植株。

CRISPR/Cas9基因组编辑

最近对草坪草的基因组和转录组分析为基因结构和表达提供了广泛的见解。然而，通过靶向基因破坏进行功能验证仍然有限。育种工作继续专注于诸如耐寒性、晚冬休眠和早春返青等性状，但传统方法耗时且常因杂合性而复杂化。基因组编辑，特别是使用CRISPR/Cas9，提供了一个强大的替代方案。

暖季型草坪草与冷季型品种相比绿期较短，限制了它们的广泛使用。在结缕草中使用根癌农杆菌介导的CRISPR/Cas9系统靶向了ZmNYC1基因。在T₀代成功获得了两个亚基因组中的ZmNYC1敲除突变。这些突变体在模拟冬季和暗诱导条件下表现出比野生型更长的持绿表型。类似地，ZjEIN2被鉴定为对结缕草持绿表型至关重要。使用CRISPR/Cas9介导的基因编辑产生了T₁代的突变结缕草植株。这些突变体在黑暗和乙烯处理条件下表现出延迟的叶片衰老，为ZjEIN2在叶片衰老中的作用提供了有力证据。这些进展标志着结缕草中CRISPR/Cas9介导基因编辑的一个里程碑。

百喜草是美国东南部广泛使用的实用草坪草。最近，使用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑成功靶向了与叶片衰老相关的叶绿素生物合成基因镁螯合酶。这种方法实现了几个MgCh拷贝的高效共诱变，导致叶绿素计测量的叶片绿度水平增加。

高羊茅是一种冷季型草坪草，在热带和亚热带地区生长时面临显著的热胁迫，特别是在夏季。其自交不亲和性和异源六倍体基因组使基因组修饰工作复杂化。为了解决这些局限性，通过结合CRISPR/Cas9和LbCas12a系统开发了一种高效的基因组修饰方法。

多年生黑麦草是另一种全球种植的流行丛生型冷季型草坪草。使用基因枪介导的粒子轰击在多年生黑麦草中进行CRISPR/Cas9基因编辑，靶向DMC1基因。产生的突变体系表现出完全的雄性不育，并且显示出严重紊乱的减数分裂。

挑战与未来展望

全球人口预计到2050年将达到90亿。与此同时，城市化预计将加剧，近三分之二的人口预计将居住在城市地区。草坪草将继续在城市绿化、居住空间和运动场中扮演不可或缺的角色，培养与城市人口的动态关系。因此，未来的草坪草发展应优先考虑可持续性，旨在实现最低维护和更高的资源利用效率，同时增强生态效益。

草坪草育种计划在改善质量方面取得了显著进展。尽管QTL研究为MAS提供了基因组靶点，但基因组学辅助育种的潜力尚未完全实现。当前可用的标记仅限于少数性状，如抗病性、抗虫性、耐旱性、冬季耐寒性、开花时间和种子生产以及某些形态特征。然而，仍然存在显著差距，强调需要扩大研究工作以准确定位与重要性状相关的基因或遗传变异，从而实现草坪草中有效的基因组学辅助育种。这种限制主要是由于缺乏完全定相的基因组序列和草坪草物种种质的基因组表征。同源和同源异源单倍型变异在多倍体草坪草物种表型多样性中的作用在很大程度上尚未探索。

最近准确、低成本的长读长测序技术和Hi-C技术的进步使得能够解析自动和异源多倍体基因组的单倍型。因此，现在可以以更高的分辨率进行草坪草的基因组表征、准确基因分型和性状定位。泛基因组已成为识别影响表型的结构变异的重要工具。在草坪草育种中，经常开发种间杂交种以增强对非生物胁迫和疾病的抗性。包含一个属内物种的泛基因组可以揭示有益的单倍型或基因，从而在育种计划中实现精确选择。正在努力为草坪草物种生成泛基因组，以阐明泛基因组变异在环境适应和农艺性状中的作用。此外，补充组学资源的发展，如转录组和表观基因组，将有助于揭示多年生草中多胁迫耐受性的分子机制。在草坪草中鉴定的有价值基因也可能转移到谷类作物，因为草坪草与水稻、玉米和高粱等谷物草具有密切的进化关系。

草坪草中许多与质量和胁迫耐受性相关的基因和调控元件仍然未知。基因编辑工具对于这些靶基因和元件的功能识别和验证至关重要。此外，管理转基因植物的监管框架正变得越来越宽松，特别是对于不掺入外来DNA的基因组编辑植物，从而为开发功能改良的作物（包括草坪草）提供了新的机会。然而，根癌农杆菌介导的转化效率通常受基因型特异性因素的限制，草坪草的转化系统仍需优化。因此，未来的研究应侧重于测试不同的根癌农杆菌菌株或采用无转化方法。优化原生质体转化方案以直接引入核糖核蛋白复合物，也可能有助于高效产生无T-DNA的基因组编辑植物。对基因组研究的持续投资，结合创新的育种策略，将对确保草坪草系统的可持续和韧性发展至关重要。