综述：基于纳米孔的生物标志物检测传感：从基本原理到转化诊断

本综述系统阐述了纳米孔传感技术（Nanopore-based sensing）在生物标志物（Biomarker）检测领域的最新进展（近5年），重点介绍了其无标记（Label-free）、单分子（Single-molecule）检测的核心优势。文章深入探讨了生物纳米孔（如α-HL, MspA, AeL）、固态纳米孔（如Si3N4, MoS2）及混合纳米孔的设计原理与信号解读策略，并详细列举了该技术在癌症、心血管、神经退行性、代谢性及传染性疾病诊断中的转化应用前景，展望了其在便携式即时检测（Point-of-care, POC）系统开发中的巨大潜力。

　　

纳米孔类型与检测原理

纳米孔传感器主要分为生物纳米孔、固态纳米孔和混合纳米孔三大类。生物纳米孔，如α-溶血素（α-HL）、外膜蛋白G（OmpG）、耻垢分枝杆菌孔蛋白A（MspA）和气单胞菌溶素（AeL），是天然存在的蛋白质通道，具有原子级精确的尺寸和良好的分子识别能力，但其机械和化学稳定性相对较低。固态纳米孔则通过微加工技术在硅 nitride（Si₃N₄）、石墨烯、二硫化钼（MoS₂）等固态材料上制备，具有优异的稳定性和尺寸可调性，但信噪比和分子穿孔速度控制是挑战。混合纳米孔结合了前两者的优点，将生物孔蛋白嵌入固态膜中，以期同时获得高分辨率和稳定性。

检测原理基于电阻脉冲传感。当施加电压时，电解质溶液中的离子会穿过纳米孔形成离子电流。当目标分子（如DNA、蛋白质）在电场作用下穿过或与孔道相互作用时，会部分阻塞孔道，导致离子电流发生瞬时下降（阻断事件）。通过分析这些电流阻断的幅度（反映分子体积/大小）和持续时间（反映分子与孔的相互作用时间或构象），即可实现对单个分子的识别和定量。

信号解读是纳米孔传感的关键环节。原始电流信号通常包含噪声，需要经过降噪、事件分割和特征提取等处理。机器学习（Machine Learning, ML）和人工智能（Artificial Intelligence, AI）技术的引入极大地提升了信号分类的准确性和效率，能够区分结构相似的分子，甚至识别复杂的多级电流波动事件，这些波动可能对应分子的构象变化或翻译后修饰。

提升特异性的策略

为了提高纳米孔传感对特定生物标志物的识别能力，研究人员发展了多种策略。

• •
  DNA载体策略：利用DNA纳米结构作为载体，将难以直接检测的小分子或蛋白质“装载”其上，使其在穿过纳米孔时产生更强、更特异的信号。例如，将三磷酸腺苷（ATP）与四面体DNA纳米结构（TDN）支持的适配体结合（TDN@ATP），可产生独特的阻断信号，显著提高了检测灵敏度。
• •
  适配体/抗体功能化：在纳米孔表面或附近固定对目标分子有高亲和力和特异性的适配体（Aptamer）或抗体（Antibody）。当目标分子被捕获时，会引起电流信号的显著变化。例如，将特异性纳米抗体（Nanobody）通过DNA连接器连接到ClyA纳米孔上，可以实现对SARS-CoV-2刺突蛋白等多种蛋白质的特异性检测。将适配体和抗体结合形成的“三明治”结构，可用于高灵敏度检测猴痘病毒（MPXV）A29蛋白。
• •
  纳米孔表面化学修饰：通过化学方法改变纳米孔表面的性质，如电荷、疏水性等，可以影响分子与孔的相互作用，从而提高选择性或减缓分子穿孔速度以利于检测。例如，使用二肽涂层修饰硅 nitride 纳米孔，可以显著提高孔的稳定性和使用寿命，并通过与涂层的相互作用减慢双链DNA（dsDNA）的穿孔速度。

疾病领域与应用

癌症与肿瘤学应用

纳米孔技术已成功应用于循环肿瘤DNA（ctDNA）、 microRNA（miRNA）、癌症相关蛋白质（如癌胚抗原CEA、血管内皮生长因子VEGF）等的检测。例如，利用MspA纳米孔结合催化发夹组装（CHA）扩增策略，可定量检测与乳腺癌相关的循环肿瘤细胞（CTCs）。利用α-HL纳米孔构建的模块化传感平台，可同时检测VEGF和基质金属蛋白酶9（MMP-9）以及环境pH值。功能化的固态纳米孔（如石英玻璃纳米孔）能够实现对CEA的单分子检测和动力学分析。

心血管疾病

纳米孔传感可用于检测心肌梗死标志物肌红蛋白（Myoglobin）、心力衰竭标志物B型利钠肽（BNP）以及炎症标志物C反应蛋白（CRP）。通过分析蛋白质酶解后的肽段指纹图谱，或直接探测肽段与纳米孔的相互作用，可以实现对这些标志物的高灵敏度识别。例如，利用α-HL纳米孔可以区分结构相似的利钠肽（ANP, BNP, CNP），并在血液基质中实现超灵敏检测。

神经系统疾病

纳米孔技术在神经退行性疾病研究中也显示出巨大潜力，可用于监测β-淀粉样蛋白（Aβ）的聚集动力学（阿尔茨海默病）、检测α-突触核蛋白（α-Synuclein）淀粉样聚集体（帕金森病），以及识别肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关的C9orf72六核苷酸重复扩增（C9-HRE）。例如，RT-FAST技术结合固态纳米移液管，可快速检测α-突触核蛋白种子。利用α-HL纳米孔可以同时检测脑脊液中的Aβ42、Aβ40等多种阿尔茨海默病相关生物标志物。

代谢性疾病

在代谢性疾病诊断方面，纳米孔传感已用于检测糖尿病肾病标志物基质金属蛋白酶2（MMP-2）、糖尿病相关氧化还原状态标志物NAD⁺/NADH、1型糖尿病自身免疫标志物谷氨酸脱羧酶（GAD65）及其抗体（GADAb），以及慢性肾病标志物视黄醇结合蛋白4（RBP4）。例如，机器学习辅助的α-HL纳米孔平台可直接、无标记地检测MMP-2活性。

传染病应用

纳米孔技术在传染病快速诊断中发挥着越来越重要的作用。通过结合CRISPR-Cas系统（如Cas12a, Cas13a）或等温扩增技术（如环介导等温扩增，LAMP），纳米孔传感器能够高灵敏度、高特异地检测病毒核酸（如HIV-1 DNA, SARS-CoV-2 RNA）。此外，通过检测病毒蛋白（如SARS-CoV-2核衣壳蛋白NP）或病毒酶活性（如流感病毒神经氨酸酶NA），也能实现病原体的识别。例如，SCAN技术将CRISPR-Cas12a与固态纳米孔结合用于HIV-1 DNA检测；人工智能辅助的纳米孔系统可直接从唾液样本中快速识别SARS-CoV-2病毒颗粒。

挑战与未来展望

尽管纳米孔传感技术取得了显著进展，但仍面临一些挑战。生物纳米孔的稳定性有待提高，固态纳米孔需要更精确、可重复的制备工艺以及更好的信噪比。对于所有类型的纳米孔，在复杂生物基质中避免非特异性吸附和背景干扰、实现多重生物标志物同时检测、以及推动设备向便携式、低成本、临床适用的即时检测（POC）系统发展是未来的重要方向。机器学习与人工智能的深度集成将进一步提升信号解读的自动化水平和准确性。最终，通过解决规模化制造、设备标准化和严格的临床验证等系统性瓶颈，纳米孔传感技术有望成为下一代诊断技术的基石，为全球精准医疗提供更快速、准确和可及的解决方案。