苹果酸通过靶向PKM2-CDC25A-CDK1轴抑制结直肠癌增殖的机制研究

本研究针对结直肠癌(CRC)代谢重编程中TCA循环中间体苹果酸(malate)的功能未知问题，通过体内外实验首次揭示苹果酸作为变构调节剂结合PKM2，诱导CDC25A泛素化降解，增强CDK1酪氨酸15位点磷酸化，从而引发G2/M期阻滞抑制肿瘤生长。该发现阐明了代谢物直接调控细胞周期的新机制，为靶向代谢-细胞周期交叉对话的癌症治疗提供了新策略。

　　

在肿瘤细胞快速增殖的过程中，代谢重编程已成为癌症的典型特征。为了适应营养应激，肿瘤细胞会重塑其代谢通路，其中三羧酸循环(TCA cycle)作为核心代谢枢纽，其多个中间产物被证实具有信号分子功能。然而，作为连接富马酸(fumarate)和草酰乙酸(oxaloacetate)的关键TCA循环中间体，苹果酸(malate)本身是否直接参与肿瘤进展调控，其具体分子机制一直悬而未解。

发表在《Molecular Biomedicine》上的这项研究，首次系统阐明了苹果酸在结直肠癌(Colorectal Cancer, CRC)中的抑癌作用及机制。研究人员发现，CRC组织中苹果酸水平显著低于癌旁组织，而苹果酸代谢关键酶MDH1、MDH2和FH的表达失调可能是导致这一现象的原因。通过构建小鼠皮下移植瘤模型，他们证实口服苹果酸能显著抑制肿瘤生长，且该效应不依赖于肿瘤免疫微环境的调节。体外实验进一步表明，苹果酸主要通过诱导细胞周期G2/M期阻滞来抑制癌细胞增殖，而非影响凋亡或迁移。

关键技术方法包括：利用裸鼠和免疫健全小鼠构建皮下移植瘤和肺转移模型进行体内药效评价；通过CCK-8、BrdU、流式细胞术等技术分析细胞增殖、凋亡和周期；采用磷酸化蛋白质组学筛选关键信号通路；结合DARTS（药物亲和响应靶点稳定性）、MST（微量热泳动）和Co-IP（免疫共沉淀）验证蛋白互作；使用临床样本进行免疫组化验证临床相关性。

Malate inhibits subcutaneous CRC

研究人员通过生物信息学分析发现，CRC患者中苹果酸代谢酶表达异常与预后相关。沉默MDH1或FH可降低细胞内苹果酸水平，而沉默MDH2则升高其水平。临床样本代谢组检测证实CRC组织中苹果酸含量降低。体内实验显示，口服苹果酸在不同剂量下均未引起明显毒副作用，但能显著抑制MC38和CT26细胞在小鼠体内的皮下肿瘤生长，而对肺转移无影响。

Malate does not affect the tumor immune microenvironment of mice

通过流式细胞术分析脾脏和肿瘤微环境中的免疫细胞群，发现苹果酸处理不影响巨噬细胞、MDSCs（髓源性抑制细胞）和T细胞的比例及活化状态，仅选择性降低肿瘤中M-MDSCs（单核样MDSCs）和脾脏中CD25⁺ T细胞比例。在单核细胞清除小鼠模型中，苹果酸仍能抑制肿瘤生长，表明其抗肿瘤作用不依赖于免疫调节。

Malate inhibits the proliferation of CRC cells by mediating cell cycle arrest

体外实验表明，苹果酸以剂量依赖性方式显著抑制MC38和CT26细胞增殖，但不诱导凋亡或影响迁移能力。流式细胞术检测发现苹果酸处理导致G2/M期细胞比例增加，提示其通过引起细胞周期阻滞发挥抗增殖作用。

Malate promotes CRC cell cycle arrest through CDC25A/CDK1 signaling

磷酸化蛋白质组学分析显示，苹果酸处理后细胞周期相关磷酸化蛋白变化最显著，其中CDK1（周期蛋白依赖性激酶1）的Tyr15位点磷酸化水平升高。使用CDK磷酸化抑制剂MK1775可逆转苹果酸的抗增殖效应。机制上，苹果酸通过泛素-蛋白酶体途径促进CDC25A（细胞分裂周期蛋白25A）降解，而不影响其mRNA水平。敲低CDC25A后，苹果酸无法诱导CDK1磷酸化及抑制肿瘤生长。

Malate binds PKM2 to regulate CRC cell proliferation and tumor progression

DARTS联合蛋白质组学筛选发现PKM2（丙酮酸激酶M2型）是苹果酸与CDC25A的唯一共同相互作用蛋白。MST和Co-IP实验证实苹果酸直接结合PKM2，且PKM2与CDC25A存在物理相互作用。敲低PKM2后，苹果酸无法下调CDC25A或增强CDK1磷酸化，亦失去抗肿瘤活性。

Malate allosterically binds PKM2 without altering its enzymatic activity or cellular glycolytic function

分子对接显示苹果酸以类似丝氨酸(Ser)的结合模式与PKM2的Arg43、Asn44等残基形成氢键，结合能为-6.159 kcal·mol^-1。Ser预处理可竞争性抑制苹果酸结合，逆转其抗增殖效应。值得注意的是，苹果酸不影响PKM2酶活性、乳酸生成及核转位，表明其作用独立于PKM2的代谢和转录功能。

Enzymes related to malate metabolism are correlated with the CDC25A-CDK1 signal pathway in CRC tissues

临床样本免疫组化分析显示，CRC组织中MDH2、FH和CDC25A表达上调，而CDK1磷酸化水平降低。MDH1和FH表达与CDC25A负相关，与p-CDK1正相关，提示苹果酸代谢紊乱与CDC25A-CDK1信号轴失调存在临床关联。

该研究首次揭示苹果酸作为非代谢性细胞周期调节剂，通过变构结合PKM2触发CDC25A降解，进而增强CDK1抑制性磷酸化从而阻滞细胞周期。这一发现不仅阐明了代谢物直接调控核心细胞周期 machinery 的新机制，还提出了靶向苹果酸-PKM2-CDC25A轴的治疗策略。值得注意的是，苹果酸在巨噬细胞中通过结合内质网伴侣蛋白BiP发挥抗炎作用，而在肿瘤细胞中通过PKM2介导抗增殖效应，这种功能选择性提示微环境因素可能决定其作用靶点。未来研究需进一步明确苹果酸代谢酶失调的上游驱动因素，以及该通路与其他代谢/信号通路的交叉对话，为开发基于代谢物调控的精准抗癌策略提供理论基础。