综述：斑马鱼吗啉寡核苷酸敲低技术：研究线粒体疾病意义未明变异功能影响的一种工具

本综述系统阐述了利用斑马鱼（Danio rerio）模型结合吗啉寡核苷酸（Morpholino Oligonucleotides, MOs）瞬时敲低技术，对线粒体疾病（Mitochondrial Diseases, MDs）中意义未明变异（Variants of Unknown Significance, VUS）进行功能验证的策略。通过MO敲低与野生型/突变型mRNA共注射的拯救实验，可有效评估变异致病性，为连接基因组数据与临床实践提供了有力工具。

　　

Abstract

斑马鱼（Danio rerio）作为一种重要的脊椎动物模型，因其胚胎透明、发育迅速、与人类基因高度保守等特点，已成为研究人类疾病，特别是线粒体疾病（Mitochondrial Diseases, MDs）的有力工具。线粒体疾病是一类高度异质性的多系统紊乱，可由核DNA或线粒体DNA（mtDNA）的遗传缺陷引起。尽管新一代测序技术（Next-Generation Sequencing, NGS）极大地扩展了与这些疾病相关的变异数量，但其中许多变异仍被归类为意义未明变异（Variants of Unknown Significance, VUS），其临床意义和致病性尚不明确，这给患者的精确诊断和治疗带来了巨大挑战。

吗啉寡核苷酸（Morpholino Oligonucleotides, MOs）是一种反义寡核苷酸，可通过与靶基因的mRNA结合，特异性阻断其翻译或剪接，从而在斑马鱼早期发育阶段实现基因的瞬时敲低（Knockdown）。这种方法能够快速模拟由基因功能缺失引起的病理表型，为研究基因功能提供了便捷途径。在MDs研究中，MO诱导的敲低能够重现关键的疾病表型，例如线粒体功能障碍、能量代谢异常、神经元缺陷或心脏发育异常等，从而为推测某个VUS可能导致的生物学后果提供体内（in vivo）证据。

然而，单纯的敲低表型尚不足以直接确认特定氨基酸改变（即VUS）的致病性。为了更精确地进行功能评估，研究人员开发了拯救（Rescue）实验策略。该策略的核心在于共注射MO与体外转录的mRNA。具体而言，研究人员会设计并合成两种mRNA：一种是编码野生型（Wild-Type）蛋白的mRNA，另一种是携带待研究VUS的突变型（Mutant）mRNA。实验通常分为三组进行对比：MO单独注射组（产生 morphant 表型）、MO与野生型mRNA共注射组、以及MO与突变型mRNA共注射组。

如果某个VUS是致病性的，预期的实验结果将是：共注射野生型mRNA能够有效弥补MO敲低造成的基因功能缺失，使斑马鱼胚胎的表型恢复正常或显著改善；而共注射该突变型mRNA则无法实现表型拯救，morphant 表型依然存在。这种“功能丧失-功能回补”的实验逻辑，为判定VUS的致病性提供了强有力的功能学证据。这种方法已经成功地将一些先前功能未知的基因与MDs联系起来，并帮助重新分类了许多意义不明的变异。

综上所述，基于MOs的敲低与拯救实验相结合的策略，在斑马鱼模型中构建了一个强大而多功能的平台，用于解决MDs研究中的功能基因组学问题。它有效地弥合了基因组数据与临床行动之间的鸿沟，为VUS的功能诠释和验证提供了宝贵工具，最终有助于缩短患者的诊断历程（Diagnostic Odyssey）。