B细胞诱导型调节性T细胞通过调控KLF4/NF-κB通路抑制巨噬细胞M1极化的机制研究

本研究针对过度炎症反应中M1型巨噬细胞异常活化这一关键问题，系统探讨了B细胞诱导的CD4+Foxp3-调节性T细胞（Treg-of-B cells）对骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）极化的调控作用。研究发现Treg-of-B细胞通过细胞接触与Th2细胞因子（IL-10/IL-4/IL-13）双重机制，诱导巨噬细胞产生中间表型，显著抑制LPS/IFN-γ诱导的M1标志物（Nos2/TNF-α/CD86）表达和炎症因子释放，并揭示该调控涉及IKBα积累和KLF4表达抑制的分子通路。该成果为炎症性疾病细胞治疗提供了新型策略。

　　

在免疫学研究领域，炎症反应的精确调控始终是科学家们关注的焦点。当机体遭遇感染或损伤时，巨噬细胞作为先天免疫的重要防线，会迅速激活并分化成不同功能亚型。其中，经典激活的M1型巨噬细胞通过产生肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）和一氧化氮合酶（iNOS）等炎症介质，有效清除病原体；然而，当M1型巨噬细胞过度活化时，则会引发"细胞因子风暴"，导致组织损伤和多种炎症性疾病，如炎症性肠病（IBD）、关节炎和代谢性疾病。目前，虽然已有非甾体抗炎药（NSAIDs）和糖皮质激素等传统治疗方法，但其长期使用往往伴随显著副作用，因此开发新型免疫调节策略迫在眉睫。

调节性T细胞（Treg）作为免疫系统的"刹车"，在维持免疫平衡中发挥着关键作用。特别引人注目的是，台湾大学研究团队此前发现B细胞能够诱导产生一种特殊的CD4⁺Foxp3^-T细胞亚群（称为Treg-of-B细胞），这类细胞虽不表达传统Treg的关键转录因子Foxp3，却高表达CTLA-4、LAG-3、ICOS等抑制性分子，并在胶原诱导性关节炎和痛风模型中展现出显著的抗炎能力。那么，这种新型调节性T细胞是否能够调控巨噬细胞的极化状态？其作用机制又如何？这些科学问题促使研究人员开展了深入探索。

为了回答这些问题，研究团队建立了一套精细的实验体系。他们首先从BALB/c小鼠骨髓中分离细胞，通过巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导分化为骨髓源性巨噬细胞（BMDMs），纯度超过90%。同时，通过磁珠分选技术获得CD4⁺CD25^-初始T细胞和B220⁺B细胞，在抗CD3/抗CD28抗体刺激下共培养3天，经Ficoll密度梯度离心去除死细胞和B细胞后，获得Treg-of-B细胞。通过流式细胞术确认，这些细胞高表达CD25但缺乏Foxp3，且表面富集ICOS、OX40、PD-1等调节性标志物。

在关键技术方法方面，研究主要采用：（1）细胞共培养体系评估Treg-of-B细胞对巨噬细胞极化的影响；（2）Transwell实验区分细胞接触与可溶性因子的作用；（3）细胞因子中和抗体明确IL-10、IL-4、IL-13的具体贡献；（4）实时定量PCR（qPCR）和蛋白质印迹（Western blot）分析基因和蛋白表达；（5）酶联免疫吸附测定（ELISA）和格里斯试剂法检测炎症因子和亚硝酸盐水平；（6）[³H]-胸苷掺入实验验证免疫抑制功能。所有动物实验均遵循台湾大学动物伦理委员会规范（许可证20210137）。

Treg-of-B细胞诱导巨噬细胞产生中间表型

当研究人员将Treg-of-B细胞与未极化（M0样）巨噬细胞共培养时，发现了一个有趣现象：巨噬细胞同时表达M2相关基因（Arg1、Retnla、Mrc1、Egr2）和部分M1标志物（Nos2、Cxcl9），呈现出独特的中间表型。这一发现打破了传统M1/M2二分类的认知，提示巨噬细胞极化实际上是一个连续谱系，而Treg-of-B细胞可能通过精细调控使巨噬细胞处于一种"适度活化"状态，既保留一定的抗菌能力，又避免过度炎症反应。

Treg-of-B细胞下调M1样巨噬细胞表型

在LPS/IFN-γ诱导的M1样巨噬细胞模型中，Treg-of-B细胞展现出强大的抗炎能力。它们剂量依赖性地抑制M1相关基因（Nos2、Tnfa、Cd86、Cxcl9）的表达，同时减少TNF-α、IL-6和亚硝酸盐的产生。值得注意的是，虽然Treg-of-B细胞能够上调部分M2标志物，但并未将巨噬细胞完全转化为M2表型，这种"部分逆转"的特性可能更有利于炎症环境的动态平衡。

Treg-of-B细胞增强抗炎细胞因子产生

机制探索发现，Treg-of-B细胞基础状态下即分泌较高水平的IL-10、IL-4和IL-13，与巨噬细胞共培养后，这些Th2细胞因子的产生进一步显著增强。尤为重要的是，这种上调是双向的——巨噬细胞自身的抗炎细胞因子表达也同步增加，形成了一种正反馈调节环路。这提示细胞间的"对话"是Treg-of-B细胞发挥功能的重要基础。

细胞接触与可溶性因子共同介导调控

通过条件培养基和Transwell实验，研究团队揭示了Treg-of-B细胞的作用机制具有双重性：一方面，细胞直接接触是抑制M1极化的主要方式；另一方面，这种接触还能诱导可溶性因子（特别是Th2细胞因子）的释放，间接发挥调节作用。当使用Transwell将两种细胞物理分隔时，抑制作用明显减弱，但若在Transwell上室同时培养Treg-of-B细胞和巨噬细胞，则仍能保留部分抑制效果，证明细胞接触触发的旁分泌信号也参与其中。

Th2细胞因子的关键作用

中和抗体实验进一步明确了不同细胞因子的贡献：IL-4主要负责抑制亚硝酸盐产生，IL-10和IL-13则协同调控TNF-α水平，而IL-6的抑制需要IL-10和IL-4的共同参与。这种"分工合作"的模式解释了为何单一细胞因子中和不能完全逆转Treg-of-B细胞的效应，也凸显了多靶点治疗策略的优势。

NF-κB通路和KLF4表达的抑制

在分子机制层面，研究显示Treg-of-B细胞能够阻止IκBα的降解，从而抑制NF-κB信号通路的活化。同时，它们还剂量依赖性地降低Krüppel样因子4（KLF4）的RNA表达——这是一个已知能与NF-κB成员p65协同激活Nos2转录的因子。这些发现为理解Treg-of-B细胞的抗炎作用提供了更深层的解释。

这项发表于《Scientific Reports》的研究系统阐明了Treg-of-B细胞调控巨噬细胞极化的新机制，不仅拓展了我们对免疫细胞间相互作用的认识，也为炎症性疾病的治疗提供了新思路。与传统Treg细胞不同，Treg-of-B细胞通过诱导中间表型巨噬细胞，在抑制过度炎症的同时保留部分免疫功能，这种"平衡调节"可能更适合慢性炎症性疾病的治疗需求。此外，该研究揭示的KLF4/NF-κB调控轴也为开发新的药物靶点提供了理论依据。

尽管目前研究仍局限于小鼠模型，且人类中是否存在类似细胞亚群尚待证实，但Treg-of-B细胞的高产率（文献报道可达70-80%）和多重免疫调节功能使其成为细胞治疗的理想候选。随着对特定免疫调节因子的进一步鉴定和临床前研究的深入，这种新型调节性T细胞有望为类风湿关节炎、炎症性肠病等难治性免疫疾病带来新的治疗希望。