线粒体腺嘌呤核苷酸转位酶1（ANT1）减少与衰老相关气道重塑的关联性研究

本文揭示了线粒体腺嘌呤核苷酸转位酶1（ANT1）在肺衰老中的关键作用。研究发现，ANT1表达随年龄增长而降低，并通过诱导细胞衰老（Senescence）和上调COL8A1表达，驱动气道重塑及功能衰退，为理解衰老相关肺疾病（如COPD、IPF）的分子机制提供了新视角。

　　

引言

衰老在肺部产生多种表型，包括肺泡气腔增大或肺气肿、表面积减少以及疾病易感性增加。细胞衰老、氧化应激和线粒体功能障碍是已知的影响因素。然而，促进不健康衰老的潜在机制仍不清楚。腺嘌呤核苷酸转位酶1（Adenine nucleotide Translocase 1, ANT1）是一种线粒体ADP/ATP转运蛋白，对线粒体代谢至关重要。ANT1的缺失通过线粒体功能障碍和细胞衰老，与以加速肺老化为特征的疾病——肺纤维化的发展有关。为了确定ANT1在正常肺衰老中的作用，研究人员分析了来自人类肺细胞图谱（Human Lung Cell Atlas）的老年人肺数据，并在老年基因敲除小鼠和体外模型中评估了ANT1相关机制。

SLC25A4（ANT1）在人和小鼠衰老肺中表达降低

为了确定肺中ANT1表达是否随年龄变化，研究人员通过人类肺细胞图谱项目的单细胞RNA测序，观察了其基因（SLC25A4）在人类肺基底细胞、纤毛细胞和肺泡II型细胞（AT2）中随年龄的表达水平。研究发现，SLC25A4表达与年龄呈负相关，尤其是在气道基底细胞和纤毛细胞中，相关系数r分别为-0.5151和-0.3246，p值均小于0.0001。在AT2细胞中也观察到显著的负相关。按性别分析时，在呼吸道基底细胞和纤毛细胞中，女性的SLC25A4表达水平高于男性；而在AT2细胞中，女性的表达水平低于男性。在男性和女性组中独立考虑年龄与SLC25A4表达的关系时，在所有三种细胞类型中均观察到SLC25A4表达随年龄增长而统计学显著下降。这些数据表明，SLC25A4（ANT1）表达随年龄增长而降低，尤其是在肺的气道细胞中。

研究人员还观察了小鼠衰老背景下Ant1的表达。来自小鼠衰老细胞图谱数据库（Tabula Muris）的批量RNA测序数据显示，雌性小鼠肺部Slc25a4表达在9个月大后随年龄增长而下降，雄性小鼠则在18个月大后出现下降。在老年A1KO小鼠中发现Ant2蛋白水平增加，这可能对此种缺失起到一定的补偿作用。因此，在人类和小鼠数据中，均表明ANT1在衰老肺中发挥作用，其水平与年龄呈负相关。

Ant1缺失导致老年小鼠出现显著气道表型

为了解ANT1在影响衰老及其肺表型效应中的作用，研究人员分析了2个月大（年轻）和22个月大（年老）的全局ANT1基因敲除（KO）小鼠及其相应的年轻和年老野生型（WT）小鼠。虽然在年轻小鼠中未观察到肺部的明显差异，但在老年WT和老年A1KO小鼠之间观察到肺结构和功能的显著差异。

在肺功能测试中，老年A1KO小鼠与老年WT小鼠相比，表现出气道阻力和呼吸系统阻力显著增加。这表明ANT1可能改变了气道上皮，从而影响了肺内的气流。与此相关，老年A1KO组的滞后性（hysteresivity）也更高。滞后性是组织阻尼与弹性的比值，代表吸气和呼气之间的经肺压差异。老年A1KO小鼠较高的滞后性水平表明每个吸气-呼气周期之间的能量损失增加。最后，与老年WT小鼠相比，老年A1KO小鼠的Loop K值降低，显示出体积无关的呼吸系统顺应性降低，暗示肺泡肺气肿减少。为了确定ANT1缺失是否改变气道结构，研究人员分析了H&E染色的肺组织切片的气道厚度。与老年WT小鼠相比，老年A1KO小鼠的气道厚度显著增加，且与气道管腔大小无关。

研究人员还测量了平均肺泡弦长（肺泡大小的测量指标）。老年WT小鼠如预期那样出现了年龄相关的肺泡增大；然而，老年A1KO小鼠的肺气肿程度减轻。此外，H&E图像显示，与老年WT小鼠相比，老年A1KO小鼠的血管周围炎症减少。虽然两组小鼠血管周围偶尔出现炎症，但老年A1KO小鼠血管周围炎症区域的数量相对于有血管的血管数量较少。此外，老年A1KO小鼠肺部血管周围炎症区域的大小相对于血管本身的大小也较小。总体而言，研究人员发现老年小鼠中Ant1敲除导致肺部形态和功能变化，这些变化与老年WT小鼠不同。这些数据表明，Ant1缺失有助于气道重塑，同时对年龄相关的炎症、肺泡增大和破坏具有保护作用。

老年Ant1基因敲除小鼠衰老标志物增加

先前研究表明，肺上皮细胞中ANT1缺失导致衰老标志物增加并加剧肺纤维化（一种加速性肺老化的疾病）。为了确定ANT1缺失在衰老背景下对衰老的影响，研究人员检测了老年动物肺组织中衰老标志物的表达。通过qPCR发现，与老年WT小鼠相比，老年A1KO小鼠中多种SASP因子的基因表达增加，包括Tnf受体基因Tnfrsf1a（Tnfr1）和Tnfrsf1b（Tnfr2），以及Ccl2。与年轻A1KO小鼠相比，老年A1KO小鼠中Il-1β和Il-6的基因表达统计学显著增加。接下来，研究人员在蛋白水平上检测了衰老小鼠模型中支气管肺泡灌洗液（BAL）中两种关键的SASP细胞因子TNF-α和IL6是否发生改变。与年轻和老年WT小鼠相比，A1KO小鼠的BAL中TNF-α和IL6均显著增加，支持了这些SASP因子产生增加的结论。研究人员还发现，与年轻小鼠（无论基因型）和老年WT小鼠相比，老年A1KO小鼠中衰老标志物Cdkn2a（p16）的基因表达增加。虽然Cdkn1a（p21）的基因表达没有统计学差异，但在老年A1KO小鼠的全肺组织蛋白裂解物中，p21蛋白水平相对于年轻WT、年轻A1KO和老年WT小鼠有所增加。肺泡II型细胞（AT2）是肺修复和再生中的重要祖细胞。通过免疫荧光检测发现，老年A1KO小鼠AT2细胞（表面活性蛋白C，SPC+细胞）和气道克拉拉细胞（CC10+细胞）中的p21蛋白表达也较老年WT小鼠增加。总之，这些结果表明，ANT1减少至少部分通过细胞衰老及其相关通路对肺部产生影响。

ANT1减少导致气道上皮COL8A1增加

为了进一步理解驱动气道形态差异和气道阻力升高的机制，研究人员利用ANT1敲低的人支气管上皮细胞系Beas-2b进行了研究。首先，对对照Beas-2b细胞和通过siRNA敲低ANT1的Beas-2b细胞进行了批量RNA测序。在差异表达最显著的基因中，与对照siRNA处理相比，ANT1敲低细胞中COL8A1和CDKN1A（P21）显著上调。正如预期，SLC25A4（ANT1）是ANT1敲低后下调最显著的基因。研究人员还观察到许多胶原蛋白基因的上调。为了验证RNA测序结果，研究人员比较了通过Crispr-cas9敲除SLC25A4（ANT1）的细胞和乱序sgRNA对照细胞。发现COL8A1蛋白水平显著增加。接下来，研究人员检测了老年WT和老年A1KO小鼠气道克拉拉细胞中Col8a1蛋白的表达。发现老年A1KO小鼠的Col8a1蛋白表达高于老年WT小鼠。最后，为了确认与年龄的关联，研究人员评估了无已知肺疾病的年轻（31-45岁）和老年（73-76岁）人肺组织中气道上皮的COL8A1蛋白表达。发现老年组气道的COL8A1表达显著高于年轻组。这些结果共同表明，与肺衰老相关的ANT1缺失导致气道上皮过量的COL8A1蛋白沉积和衰老增加，并为衰老过程中气道重塑的发生提供了额外的机制。

讨论

衰老是生物学的一个必要方面；然而，了解促进健康衰老和预防功能上显著的“不健康”或病理性衰老的因素至关重要。肺部的加速病理性衰老可导致慢性阻塞性肺疾病（COPD）、肺纤维化和肺癌等疾病。此外，线粒体功能障碍与衰老密切相关，包括形态、代谢和信号传导的改变。本研究首次证明线粒体ATP转运蛋白ANT1在肺衰老的发病机制中起着重要作用。研究表明，ANT1表达在老年成人和老年小鼠的肺上皮细胞中降低，并与病理性气道变化相关。老年Ant1缺失小鼠表现出气道厚度增加、肺功能测试显示气道阻力增加、上皮细胞衰老增加以及气道中胶原蛋白VIII积聚增加。这些发现支持了ANT1缺失、细胞衰老和COL8A1变化之间存在关联。研究人员在老年人气道中证实了这些发现。这些发现表明，衰老过程中ANT1的减少有助于气道重塑，这可能是通过基质重塑和衰老介导的，这些特征导致了年龄相关的肺功能障碍。

VIII型胶原已知由内皮细胞、炎症细胞和角膜上皮细胞产生。本研究数据支持气道上皮细胞也能产生VIII型胶原，表明它可能有助于气道和组织僵硬。肺领域的许多研究关注胶原蛋白I和IV，它们在肺纤维化和慢性阻塞性肺疾病（COPD）的细胞外基质重塑中发挥重要作用，这两种疾病都被认为是加速性肺老化疾病。然而，关于胶原蛋白VIII的数据有限。研究发现COPD和各种癌症患者血清中胶原蛋白VIII升高，但肺纤维化患者中未见此现象。虽然本研究在肺上皮细胞背景下研究了胶原蛋白VIII，但进一步研究肺内皮细胞将非常有趣，并可能产生重要发现。

ANT1缺失诱导的线粒体功能障碍也对加速性肺老化疾病如肺纤维化有影响。无论是在衰老还是肺部疾病中，理解将健康衰老转向病理性衰老的细胞因素都至关重要。研究人员观察到ANT1缺失导致衰老和COL8A1表达增加，这可能通过旁分泌SASP因子进一步传播。研究人员假设，由ANT1缺失驱动的代谢功能障碍和氧化应激调节气道上皮中的胶原表达和细胞因子等SASP因子。未来的研究有必要了解ANT1表达在衰老过程中是如何被调控的，连接ANT1缺失与基质和细胞因子变化的信号通路，以及这是否代表一个治疗机会。由于对ANT1在肺部疾病中的作用知之甚少，重要的未来方向包括更清晰地了解ANT1按细胞类型产生的效应（这可能不同并可能导致不同的分子信号传导，从而改变细胞命运决定、SASP因子传播和基质重塑）。研究发现ANT1过表达会促进细胞凋亡，这表明增强ANT1需要谨慎进行。

先前ANT1与人类健康和疾病的关联大多集中在肺外器官系统。ANT1突变已知导致心肌病、进行性眼外肌麻痹和双相情感障碍等疾病。ANT1表达降低也与一些癌症有关，包括横纹肌肉瘤和乳腺癌。然而，研究团队先前也确立了ANT1水平降低与特发性肺纤维化（IPF）之间的联系。总体而言，虽然ANT1与衰老相关病理有关，特别是在IPF和癌症中，但本研究首次确立其与一般衰老的联系。研究表明，非吸烟者中存在气道或支气管壁增厚这一年龄相关表型。本研究结果表明，ANT1缺失可能加速这种表型，并可能在肺部受到刺激（如香烟烟雾或空气污染）时进一步加速气道疾病和肺重塑，导致肺部疾病。研究人员还提供了ANT1介导肺衰老效应的潜在机制，即通过COL8A1和衰老导致的阻力增加和厚度增加。研究团队最近发表文章称，年轻ANT1KO小鼠免受香烟烟雾诱导的肺气肿影响，并且这种表型是由单核细胞和巨噬细胞中ANT1缺失介导的。ANT1KO单核细胞和巨噬细胞存在迁移能力缺陷，从而产生了这种保护作用。这表明在衰老模型中发生了类似的炎症细胞迁移缺陷，导致炎症浸润改变和衰老过程中空气空间增大减少，这与在香烟烟雾诱导的肺气肿模型中观察到的表型一致。总之，这项研究有助于理解肺衰老，为未来研究衰老相关肺部疾病的起始和进展奠定了基础。

本研究的局限性包括使用了全局ANT1 KO小鼠。由于敲除并非针对特定细胞（如AT2或气道细胞），因此无法确定是哪些特定细胞和组织驱动了观察到的ANT1介导的变化。研究人员观察到老年Ant1缺失小鼠肺组织中Ant2蛋白表达出现补偿性增加。先前已证明Ant2表达增加对肺具有保护作用，因此可能有助于某些保护性表型方面，例如与衰老相关的肺泡增大减少。

结论

本研究提供证据表明，丰富的线粒体ADP/ATP转运蛋白ANT1通过调节衰老和胶原介导的气道重塑，在肺衰老的发病机制中起着重要作用。治疗性靶向和增强ANT1表达可能作为预防肺衰老过程中气道重塑的一种方法。