骨量流失与TLR4信号独立调控B系细胞衰老的新机制

本研究发现B系祖细胞在年轻小鼠骨髓中富集于骨组织附近，尤其是骨小梁区域；而衰老伴随的骨质流失会导致这些区域B细胞祖细胞耗竭。通过多种小鼠模型证实，维持骨量可显著延缓B淋巴细胞生成（B lymphopoiesis）的年龄相关性衰退，而同时阻断TLoll样受体4（TLR4）信号通路则可完全逆转此过程。该研究首次揭示B系细胞衰老不仅受抑制性信号增强影响，更与有益信号（如骨源性信号）的缺失密切相关，为理解免疫衰老提供了新视角。

　　

B系细胞在骨髓中的空间分布与衰老关联

ABSTRACT

B细胞发育随年龄增长而衰退，但骨髓环境的结构性变化如何参与此过程尚不完全清楚。多重体积成像技术揭示，在年轻小鼠中，B系细胞在骨骼附近，特别是骨小梁区域富集。然而，在表现出老年性骨质疏松的老龄小鼠品系中，B细胞祖细胞从这些区域耗竭。与此形成鲜明对比的是，在终生维持骨量的小鼠中，与年龄相关的B淋巴细胞生成衰退得以减弱，并且通过同时阻断TLR4信号可以完全消除这种衰退。这些结果不仅证明发育中的B系细胞在骨髓中并非随机分布，而且表明与年龄相关的B淋巴细胞生成衰退受到有益信号丧失的影响，而不仅仅是抑制性信号增加的影响。

1 Introduction

骨髓是出生后B细胞发育的场所，该过程在年轻个体中十分活跃。然而，学界共识认为B淋巴细胞生成随年龄增长而减弱，导致发育各阶段的细胞数量显著减少。例如，常见淋巴祖细胞（CLPs）、祖B细胞（pro-B cells）、前B细胞（pre-B cells）和新产生的幼稚B细胞（naive B cells）的数量均随年龄增长而减少。相比之下，髓系生成（myelopoiesis）在衰老过程中得以维持。B细胞祖细胞随时间推移而部分丧失是由于骨髓环境的改变，因为老年小鼠的淋巴偏向性造血干细胞移植到年轻宿主体内后具有正常的B细胞潜能。

另一种观点认为，与年龄相关的B细胞祖细胞丧失是由于抑制性信号（如炎症增加）的积累。这一结论得到以下报告的支持：包括肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-1（IL-1）和集落刺激因子（CSFs）在内的炎性细胞因子可以在体外或体内直接或间接抑制B淋巴细胞生成。这些细胞因子随年龄增长而增加的产生可能由持续的Toll样受体4（TLR4）信号传导所促进。这是由于肠道通透性增加，导致循环中TLR4配体（如脂多糖LPS）水平升高。因此，年龄增长带来的慢性TLR4信号传导被认为是炎症增加（即"炎症衰老"）的主要驱动因素。

如果炎症衰老驱动了B细胞祖细胞的丧失，那么降低炎性细胞因子水平应能减缓这种衰退。然而，先前的研究报告显示，积极使用IL-1和TNF-α抑制剂治疗老年C57BL/6（B6）小鼠，甚至未能微量恢复B淋巴细胞生成。这一结果表明，需要重新评估炎症衰老对B细胞发育年龄相关性衰退的贡献，并提示骨髓环境中的其他变化，替代或附加于炎症，导致了B细胞祖细胞随时间的丧失。

大量文献表明B淋巴细胞生成依赖于骨系细胞（osteolineage cells）的信号。这些骨源性信号很可能是必需的，因为导致骨质流失的基因缺失会引发B淋巴细胞生成减弱。有趣的是，据报道CLPs位于骨内膜附近。然而，其下游后代是否也是如此尚不清楚，因为B细胞祖细胞在骨髓中的精确分布尚未完全绘制，尤其是在长骨中。此外，关于衰老如何影响B系细胞在骨髓中分布的理解也十分有限。

研究者通过优化组织透明化和成像方案来解决这些知识空白，从而能够可视化B系细胞在整个生命周期中在骨髓内的定位。研究最初聚焦于B6小鼠，因为该品系小鼠的B淋巴细胞生成随年龄增长而衰退，并且B6背景的小鼠表现出显著的老年性骨质疏松。对年轻B6小鼠股骨的成像显示，大多数B系细胞确实位于骨骼附近，尤其是骨小梁附近，这为支持骨骼支持B淋巴细胞生成的研究提供了视觉证据。对老年B6小鼠股骨的进一步成像显示，B系细胞从骨骼退化的骨髓区域丧失，仅主要保留在骨骼仍然完好的区域。

研究随后将分析扩展到额外的小鼠模型，这些模型要么随年龄增长维持骨量，要么表现出骨质流失。由于这些处于B6和C3H背景的品系同时也是TLR4缺陷或充足的，这也使得研究者能够在骨量维持或丧失的情况下，测量TLR4诱导的炎症对B系细胞衰老的贡献。结果表明，骨骼的丧失或维持是决定B淋巴细胞生成随年龄衰退或维持的主要因素。数据进一步显示TLR4信号可以抑制B淋巴细胞生成，但其效应更为微妙，主要影响处于前B细胞发育阶段的细胞。研究还发现，任何非TLR4信号诱导的炎症都不足以阻断B细胞发育。

总之，本研究的结果表明，与年龄相关的B淋巴细胞生成衰退不仅仅是由于骨髓环境中抑制性信号的积累，也是由于有益信号的丧失，这为理解正负信号之间的平衡如何在整个生命周期中调节B淋巴细胞生成水平提供了新的视角。

2 Results

2.1 B系细胞在骨骺/干骺端与骨骼和血管系统相关联

研究者结合组织透明化过程与体积成像技术，可视化B6小鼠骨髓中B系细胞的分布。清除后的骨骼用CD19抗体标记，CD19从祖B细胞到成熟B细胞阶段均有表达。然而，年轻小鼠骨髓中表面IgM⁺ B细胞占比不超过10%，因此该组织中大多数CD19⁺细胞是B细胞祖细胞。使用大鼠抗小鼠CD19一抗和驴抗大鼠二抗孵育清除后的骨骼，可检测到CD19⁺细胞。仅使用二抗孵育的骨髓样本未显示任何可辨别的信号。成年B细胞发育在PU.1亚效等位基因小鼠中被阻断，其骨髓中很少有CD19⁺细胞被CD19一抗和二抗标记。在B6小鼠肺中也观察到很少的CD19⁺细胞，但用内皮黏液素（Emcn）抗体标记显示了该组织中广泛的血管网络。Emcn⁺血管通常共表达CD31，研究者也观察到了这一点。研究者还使用了Imaris平台上的各种计算工具来扩展可从二维图像中获得的信息。例如，使用表面功能揭示了CD19⁺ B系细胞与瘦素受体（LepR）⁺基质细胞之间的密切关联。

骨骺和干骺端包含广泛的骨小梁网络，研究者通过微型计算机断层扫描（μCT）证实了这一点。对用CD19抗体标记的清除后B6小鼠股骨成像显示，这些区域存在大量密集的CD19⁺细胞簇。低倍成像无法分辨单个CD19⁺细胞，但更高倍数的视图显示CD19⁺簇包含直径6-9 μm的细胞，与中小型淋巴细胞一致。

骨骼也用Emcn抗体标记，显示除了骨小梁之外，骨骺/干骺端还存在广泛的血管网络。这些图像的表面渲染提示，H型血管（Type H vessels）——为骨髓供血的动脉分支——因其垂直于生长板的独特平行排列方式而在干骺端被识别。这些结果与关于骨小梁的形成和维持依赖于丰富的营养和氧气供应的报告一致。

B系细胞通常在骨骺/干骺端的不同区域局域化。例如，在许多图像中观察到CD19⁺细胞靠近生长板，但这是否意味着发育中的骨骼区域为B淋巴细胞生成提供了有益环境仍有待确定。CD19⁺细胞在不同区域的分离在骨骺中尤为明显。远端骨骺的横截面图像显示了不同的DAPI⁺ CD19⁺和DAPI⁺ CD19^?簇的存在，并进一步突出了它们的优先分布。具有成骨潜能的基质细胞为CLPs提供了生态位，这些骨祖细胞往往位于小动脉和H型血管附近。这些支持性基质细胞在骨骺不同区域的定位是否有助于CD19⁺细胞的局域化仍有待确定。

2.2 骨干中的CD19⁺细胞位于骨内膜附近

骨干包含有限的骨小梁，通常局限于干骺端和骨干本身之间的过渡区。骨干中点很少有骨小梁。用DAPI和抗CD19抗体标记的骨干横截面显示，虽然CD19⁺细胞广泛分布于整个骨干，但它们集中在骨内膜附近。对CD19⁺区域宽度和髓腔直径的测量揭示了这些参数之间普遍存在但不绝对的相关性。在这方面，最窄的CD19⁺细胞区域最常在骨干最窄的部分观察到，而最宽的区域则在直径大于1.2 mm的骨干区域发现。μCT图像显示，骨干最窄的区域包含很少或没有骨小梁，而直径较大的区域通常邻近干骺端并包含骨小梁。

2.3 每个骨骺/干骺端中的B细胞祖细胞数量与骨干相同

研究者随后从股骨收集造血细胞，并使用流式细胞术确认各个区域存在的大多数B系细胞是祖细胞而非成熟B细胞。将13周龄B6小鼠的股骨切成三个部分，并基于Hardy等人定义的表型，对骨骺/干骺端和骨干中的总细胞数以及B细胞祖细胞数量进行计数。

所有区域都含有祖B细胞、前B细胞和幼稚B细胞。先前描述的同系B6小鼠之间B细胞祖细胞数量的差异在分析中也观察到。所有区域的B系细胞频率和数量平均而言与骨干相似。这一点很显著，因为骨干构成了股骨长度的60%以上。为了解释每个区域细胞回收率的差异，研究者将每个区域每百万细胞中每个祖细胞阶段的数量进行了标准化，数据证实祖B细胞、前B细胞和幼稚B细胞在骨骺/干骺端的存在水平与在骨干中相同。事实上，近端骨骺/干骺端每百万骨髓细胞中祖B细胞的频率和数量显著高于骨干，但这是否是由于前者区域骨小梁密度更高仍有待确定。总之，这些数据支持发育中的B系细胞存在于富含骨小梁的区域这一结论。结果进一步表明，为便于冲洗造血细胞而切断并丢弃长骨末端的行为，会丢弃大多数B细胞祖细胞。

2.4 衰老过程中B系细胞从骨骼丧失的区域耗竭

到中年时，B6小鼠在祖B细胞向前B细胞过渡阶段出现阻滞，导致祖B细胞频率增加和前B细胞丧失。然而，随着年龄增长，老年小鼠的祖B细胞频率低于年轻小鼠。研究者量化了近端和远端骨骺/干骺端中的B细胞祖细胞。虽然不同区域祖B细胞和幼稚B细胞的丧失情况各异，且并非总是在年轻和老年B6小鼠之间存在显著差异，但一个一致的发现是，与年轻B6小鼠相比，老年B6小鼠股骨所有区域的前B细胞频率均显著降低。

研究者对老年B6小鼠远端干骺端的大区域进行成像，以可视化剩余B系细胞的定位。与在年轻小鼠中观察到的CD19⁺细胞存在于距生长板数百微米朝向骨干的区域相反，老年干骺端中的CD19⁺细胞主要位于骨内膜附近。μCT扫描进一步揭示，干骺端中央区域CD19⁺细胞的稀缺与该区域骨小梁的丧失相关，这与先前关于B6小鼠发生严重老年性骨质疏松的报告一致。与干骺端CD19⁺细胞的严重丧失形成对比，它们在老年小鼠骨骺中的分布更为广泛，这与股骨该区域骨小梁仍然存在的事实一致。

有报道称B6小鼠的血管系统随年龄增长而恶化。对老年B6小鼠清除后股骨用Emcn抗体标记证实了这些报告。研究者观察到，推测的H型血管在老年B6小鼠的干骺端是紊乱的，但使用表面渲染分析这些图像显示，可能包括血窦在内的血管遍布干骺端，包括骨骼已经丧失的区域。然而，表面渲染图像再次显示CD19⁺细胞通常不存在于这些区域，而是定位于骨骼仍然存在的区域，这表明仅靠血管系统效率低下地支持B细胞发育。

2.5 TLR4缺失不能挽救B6小鼠的B细胞发育

上述数据暗示骨质流失是B系细胞衰老的关键驱动因素。然而，由于野生型B6小鼠TLR4信号完整，TLR4诱导的信号可能是观察到的B细胞祖细胞丧失的原因。研究者通过检查缺失Tlr4基因（编码TLR4）的B6小鼠的B细胞发育来评估这一点。远端股骨的μCT扫描显示，与其B6背景一致，到中年时B6TLR4^?/?小鼠的骨小梁丰度降低，剩余骨小梁之间的间距增加。因此，B6TLR4^?/?小鼠使得研究者能够在TLR4信号缺失的情况下评估骨质流失对B细胞发育的影响。中年B6TLR4^?/?小鼠在祖B细胞向前B细胞过渡阶段存在阻滞，导致祖B细胞数量显著升高；因此，TLR4信号的缺失似乎并未改变B淋巴细胞生成年龄相关性变化发生的动力学。前B细胞和幼稚B细胞也显著减少。同样，即使比较的是同系小鼠，无论性别如何，B细胞祖细胞的频率都存在小鼠个体间的差异，如前所述。总之，对B6TLR4^?/?小鼠的分析表明，当骨量未维持时，TLR4缺陷无法阻止B细胞发育的年龄相关性衰退。

2.6 B细胞发育在老年C3H/HeJ小鼠中不衰退

如果骨质流失是B系细胞衰老的主要驱动因素，那么在骨量随时间推移得以维持的小鼠品系中，B细胞发育的衰退应被消除或减弱。研究者使用C3H/HeJ小鼠测试了这一点，依据是该品系骨体积高，并且其随年龄衰退的速度不如B6小鼠剧烈。μCT图像证实老年C3H/HeJ小鼠骨量广泛。比较年轻和老年C3H/HeJ小鼠的B淋巴细胞生成显示，B细胞发育不随年龄衰退。年轻和老年动物的祖B细胞、前B细胞和幼稚B细胞的频率和数量相似。C3H/HeJ小鼠的骨髓细胞数随年龄稳定或升高，表明B系细胞总数也未随时间下降。

除了维持高骨量外，C3H/HeJ小鼠的特点还在于Tlr4基因突变导致TLR4信号传导缺陷。因此，C3H/HeJ数据表明，维持骨量和阻断TLR4信号可以阻止B细胞发育的年龄相关性衰退。这些结果进一步表明，任何超出TLR4信号诱导水平的炎症增加都不会导致年龄相关的B细胞祖细胞丧失。否则，应在老年C3H/HeJ小鼠中观察到B细胞发育的阻滞。

2.7 B淋巴细胞生成的衰退在老年C3H/HeOuJ小鼠中减弱

对B6TLR4^?/?小鼠的分析表明，当骨量未维持时，消除TLR4信号不能阻止B细胞发育的年龄相关性衰退。然而，一个悬而未决的问题是，当骨量随年龄增长保持高位时，TLR4信号是否对B细胞发育有任何负面影响。研究者检查了TLR4充足的C3H/HeOuJ小鼠以解决这个问题。C3H/HeJ和C3H/HeOuJ是遗传相似的品系，C3H/HeOuJ小鼠也具有高的股骨骨量。研究者的μCT扫描显示，C3H/HeOuJ小鼠股骨中的骨小梁随年龄增长得以维持。广泛的血管网络也存在于股骨干骺端，这与骨小梁形成和维持依赖于血管信号一致。因此，C3H/HeOuJ小鼠使得研究者能够在TLR4信号完整的情况下评估骨量维持对B细胞发育的影响。B细胞祖细胞的量化显示，C3H/HeOuJ小鼠的祖B细胞区室基本得以维持。前B细胞和幼稚B细胞的频率显著下降，但这种丧失的严重程度低于B6背景小鼠发生的情况。这些数据表明，即使骨骼得以维持，TLR4信号仍会促进B细胞发育的年龄相关性衰退，但其效应比以往认识到的更具阶段特异性。由于祖B细胞和前B细胞表达可忽略不计的TLR4水平，任何由TLR4信号导致的前B细胞丧失必定是间接介导的。

3 Discussion

本研究的结果证明，年轻小鼠中的大多数B细胞祖细胞邻近骨骼，从而为支持骨骼支持B细胞发育的大量报告提供了视觉证据。研究者还发现，发育中的B系细胞从随年龄发生骨质流失的骨髓区域丧失，仅保留在骨骼得以维持的区域。

先前对骨髓中小范围且通常未定义区域的成像导致结论认为祖B细胞和前B细胞与靠近血窦的基质细胞相关联；事实上，这些论文中的总结图描绘了B细胞祖细胞与血窦之间的这种密切关联。研究者的数据并不否定这些结果，因为骨髓中的基质和血窦细胞网络是广泛的，研究者也观察到一些CD19⁺细胞与骨干更中央区域的血窦相关联。然而，研究者的图像清楚地表明B系细胞在缺乏骨骼的骨髓区域稀疏，这表明仅靠窦周基质细胞不能为B淋巴细胞生成提供最佳环境。Morrison实验室报告称，具有谱系阴性、CD127（IL-7受体）⁺表型的细胞（可能是CLPs）位于骨骼的骨内膜表面附近，而研究者的数据表明它们的CD19⁺后代也是如此。关于CLPs距离骨内膜的距离存在争议，研究者的数据为此提供了新的视角。在这方面，研究者观察到CD19⁺区域在一些骨干区域非常狭窄，而在其他区域则更为广泛。骨干不同区域的μCT扫描表明，最窄的CD19⁺细胞区域发现于骨干直径较小、包含很少骨小梁的区域。相比之下，CD19⁺区域在髓腔直径较大、包含骨小梁的区域更宽。这些观察结果表明，在骨干的一些区域，CLPs及其下游CD19⁺后代可能靠近骨内膜，而在其他区域，它们可能位于更远但仍靠近骨骼的位置。鉴于这些考虑，先前报告中关于CLPs距离骨内膜远近的不同结论可能都是正确的，这取决于成像的区域。

骨系细胞以几种方式支持B淋巴细胞生成。例如，成骨细胞是必需B淋巴细胞生成因子IL-7的来源，尽管并非所有研究组都同意这一发现。表达Osterix的骨细胞前体可以通过分泌胰岛素样生长因子-I（IGF-I）促进祖B细胞向前B细胞过渡。它们也可能通过维持支持淋巴细胞发育的基质细胞来独立促进B淋巴细胞生成。这些观察为理解年龄增长导致的骨骼和骨细胞前体丧失如何引起B细胞发育衰退提供了基础。骨系信号提供的支持性环境的丧失，连同炎症水平升高，也可能导致老年骨髓中存在的少量B细胞祖细胞出现内在缺陷。这些缺陷包括p16^Ink4a和Arf表达增加，导致其生长和存活能力降低。老年B细胞祖细胞的E2A转录因子和替代轻链表达也发生改变。然而，这些观察是基于对随年龄发生骨质流失的品系中B细胞祖细胞的分析。确定在未发生老年性骨质疏松且炎症衰老水平较低的小鼠中，祖B细胞和前B细胞的这些细胞内在变化是否被消除将是有趣的。

除了骨骼，CD19⁺细胞定位的区域还包含广泛的血管网络。这在骨骺/干骺端尤为明显。干骺端中垂直于生长板取向的血管因其高表达CD31和内皮黏液素而被称为H型血管。研究者未测量用针对这两种决定簇的抗体标记的强度，但成像显示了彼此平行且垂直于生长板取向的血管的存在，如所述。骨骼和H型血管存在于同一区域反映了这两种结构的相互依赖。例如，H型血管中丰富的营养物质（是服务于骨髓的动脉的直接分支）支持骨小梁的形成和维持。成骨细胞反过来以旁分泌方式调节血管生成和H型血管。因此，H型血管的丧失导致骨质流失，而骨质流失又导致H型血管丧失。无论哪个先发生，都会启动一个恶性循环，导致骨小梁丧失，这对B细胞发育有害。由于H型血管营养丰富，而B细胞祖细胞代谢活跃，它们随年龄恶化可能进一步损害B细胞发育。然而，血管在老年动物的干骺端仍然存在，但CD19⁺细胞却不存在，这表明缺乏骨骼的血管系统效率低下地支持B细胞发育。

研究者还分析了骨骼和TLR4信号之间的平衡如何促进B淋巴细胞生成的年龄相关性衰退。对处于B6和C3H背景的不同品系的分析使得研究者能够量化在骨量高或低、TLR4表达存在或缺失的环境中的B细胞祖细胞。从C3H/HeJ小鼠获得的结果表明，当骨量得以维持且TLR4信号缺失时，B细胞祖细胞的年龄相关性丧失可以被完全阻止。从C3H/HeJ数据得出的另一个结论是，不依赖于TLR4信号的炎症增加不足以抑制B细胞发育。如果是这种情况，C3H/HeJ小鼠的B细胞发育本应受到抑制。

然而，当骨量下降或TLR4信号完整时，会发生B细胞祖细胞的丧失。例如，即使B6TLR4^?/?小鼠的TLR4信号被阻断，它们也存在骨质流失，并且到中年时B细胞祖细胞数量显著下降。类似地，C3H/HeOuJ小鼠也发生B细胞祖细胞丧失，因为尽管骨量在整个生命周期中都很高，但TLR4信号是完整的。然而，C3H/HeOuJ数据表明TLR4诱导的信号对B细胞祖细胞的效应是微妙的。在这方面，老年TLR4充足的C3H/HeOuJ小鼠的祖B细胞区室基本完整，表明TLR4信号对处于此发育阶段的B细胞祖细胞仅有 modest 影响。因此，骨源性信号（其中一些可能通过B细胞祖细胞与骨系细胞之间的直接接触提供）足以维持祖B细胞区室，即使TLR4信号发生。相比之下，老年C3H/HeOuJ小鼠的前B细胞存在显著丧失，表明即使骨量得以维持，TLR4信号仍能影响此发育阶段。这可能是由于祖B细胞向前B细胞过渡的阻滞和/或对新产生的前B细胞存活的影响。然而，必须强调，C3H/HeOuJ小鼠前B细胞丧失的幅度不如野生型B6小鼠发生的那么严重。

由于TLR4信号可促进炎症衰老，而炎性细胞因子可抑制B细胞发育，一个保守的结论是C3H/HeJ小鼠的Tlr4缺陷有助于该品系中B淋巴细胞生成的维持，而TLR4信号驱动了C3H/HeOuJ小鼠前B细胞的丧失。研究者显示祖B细胞和前B细胞不表达TLR4的数据表明，TLR配体与骨髓和/或系统环境中的非B系细胞结合间接影响了前B细胞区室。然而，是否存在除Tlr4表达之外的遗传差异是研究结果的基础，因为C3H/HeJ和C3H/HeOuJ小鼠并非同系。研究者认为这不太可能，因为除了Tlr4之外，两个品系之间存在的遗传差异非常少。C3H/HeJ小鼠表达棘波放电1基因，而C3H/HeOuJ小鼠不表达。它们还在6号染色体上有一个倒位，但该倒位与任何表型无关。最后，可转座重复元件景观在两个品系之间也不同，但这在同系野生型和C57BL/6基因敲除小鼠中也是如此。然而，没有证据表明这些差异中的任何一个会影响B细胞发育。

研究者的数据表明，炎症衰老对B细胞发育衰退的影响是有限的。这一结论似乎与炎症阻断B细胞发育的普遍观点相左，也与白细胞介素-1和集落刺激因子等在体外和体内广泛抑制B淋巴细胞生成的报道相悖。然而，炎症在阻断B淋巴细胞生成中的作用是基于急性、实验诱导的炎症（如给小鼠注射LPS或各种细胞因子）的效应。相比之下，与衰老相关的慢性炎症已被证明是较低程度的，研究者认为炎症衰老对B细胞发育的影响仅是中度的。这一结论与研究者先前提到的数据一致，即同时使用IL-1和TNF-α抑制剂治疗老年B6小鼠未能恢复B细胞发育。有趣的是，后一种治疗在老年小鼠中将升高的髓系祖细胞水平降低到年轻动物中观察到的水平，表明炎症衰老促进了年龄相关的髓系偏向。

研究者考虑了B细胞发育在老年C3H小鼠中普遍完整而B6小鼠中衰退的其他解释。没有理由认为支持性基质细胞整体网络维持的差异是原因，因为除了具有骨系潜能的基质细胞丧失外，B6小鼠中表达CXCL12的基质细胞的数量和组织随时间是稳定的。另一方面，C3H小鼠的胰岛素样生长因子-1水平高于B6小鼠，而IGF-I可与IL-7协同增加祖B细胞增殖。因此，高水平的IGF-I可能独立于其他信号直接支持B细胞发育。然而，IGF-I也促进骨骼生长和维持，而osterix⁺骨祖细胞是骨髓中IGF-I的来源。因此，当考虑B6和C3H背景小鼠之间的差异时，骨系细胞是否随年龄得以维持仍然是解释这些品系之间B细胞发育差异的统一因素。

研究者的结果证明，分析多种小鼠品系对于理解在整个生命周期中调节B细胞发育的信号至关重要。有趣的是，如果盲目地合并各种近交系小鼠然后取样，一些动物会显示B细胞祖细胞随年龄丧失，而其他动物的B细胞发育则不会衰退。一份检查年轻和老年人B细胞发育的报告也显示，B淋巴细胞生成在许多个体中是稳定的，而其他个体则表现出淋巴细胞前体随年龄丧失。因此，对各种近交系小鼠的联合检查可以作为理解为什么一些老年人B淋巴细胞生成随年龄衰退而其他人则不衰退的基础。无论如何，当前结果支持一个模型，即骨骼提供的有益信号丧失是B淋巴细胞生成年龄相关性衰退的主要驱动因素。这一结论为理解后者过程为何随年龄恶化提供了新的视角，因为主流模型认为这是由于抑制性信号增加。结果也提供了一个清晰的例子，说明如何利用多重和多尺度的体积成像来可视化B细胞发育以及环境变化如何损害该过程。

4 Methods

4.1 小鼠

C57BL/6（B6）、B6（Cg）-Tlr4^tm1.2Karp/J、C3H/HeJ和C3H/HeOuJ雌雄小鼠购自杰克逊实验室，饲养于UCLA实验动物医学部。

4.2 造血细胞收集

从股骨分离肌肉和结缔组织后，进行两次切割，得到近端和远端骨骺/干骺端以及骨干部分。通过压碎各部分收集造血细胞。使用红细胞裂解液裂解红细胞。使用血球计数板进行细胞计数。

4.3 流式细胞术

所有染色程序在冷的无钙镁PBS中进行。样品首先用CD16/32抗体孵育以阻断抗体通过Fc受体与细胞的非特异性结合。用于表面染色，细胞在冰上与适当稀释的抗体孵育30分钟。染色的样品在BD LSRII上运行。使用