基于环境DNA宏条形码技术从局域到国家尺度的岩相潮间带生物多样性表征研究

本研究通过环境DNA（eDNA）宏条形码技术，首次在英国范围内系统评估了岩相潮间带生物多样性在三个空间尺度（国家、区域和局域）的检测效能。研究采用COI和18S双标记策略，从32个样点的不同潮位带（高潮带岩池、低潮带岩池和开放海水）采集水样，成功鉴定出19门442科1026个目标类群。结果显示eDNA信号在所有空间尺度均呈现显著差异，且地理位置的区分度（伪F=3.50, p<0.001）优于垂直潮位高度（伪F=2.78, p<0.001），表明小尺度存在DNA均质化效应。研究证实eDNA检测能准确反映潮间带经典生态模式：物种丰富度随潮位升高而降低（χ2=201.4, p<0.001），北方物种检测率随纬度升高而增加（苏格兰达89.9%）。该工作为动态海洋环境的多尺度生物多样性监测提供了标准化方案。

　　

ABSTRACT

高效且可扩展的海洋生物多样性监测方法对于理解沿海环境生态变化至关重要。环境DNA（eDNA）宏条形码技术显示出监测沿海类群的潜力，但其区分不同地理位置群落的能力尚未得到充分理解，特别是在动态海洋环境中。本研究评估了eDNA宏条形码在英国三个空间尺度（国家、区域和局域）检测岩相潮间带类群的有效性和分辨率。从英国五个区域海的32个样点采集了潮上带表层水样，包括高潮带和低潮带岩池以及直接来自海水的样本。使用针对无脊椎动物（COI）和大型藻类（18S）的两种成熟标记，共检测到19门442科1026个目标类群。在所有空间尺度均发现独特的eDNA信号，表明即使在同一地点的不同垂直海岸高度之间也存在局部离散性。大尺度（区域间）的群落离散度高于小尺度（潮位带间）。eDNA信号更受地理位置而非垂直潮位高度的调控，这可能是小空间尺度上潮汐周期内DNA均质化程度更高的结果。已建立的生态分带模式在eDNA信号中得到反映，低潮带具有更高的丰富度，体现了非生物胁迫梯度。冷亲和性北方物种的检测随纬度增加而增加，暖亲和性卢西塔尼亚物种则随纬度升高而减少。本研究支持eDNA宏条形码在动态海洋环境中进行多尺度生物多样性监测的实用性，并建议采用尺度适宜的采样方案以优化eDNA效益。

方法

采样点选择与设计

在2022-2023年夏季（6-9月）对英国五个区域海的32个岩相潮间带样点进行采样。样点选择基于四大标准：具有广阔潮间带岩礁、远离人类活动区、研究人员可安全通行、覆盖广泛地理范围。每个样点设置100米采样断面，采用嵌套式采样设计（图1c）：在每个样点随机采集9个1升水样（每个水样由两个500毫升子样本混合），其中高潮带岩池、低潮带岩池和开放海水各3个重复样本。高潮带岩池采样靠近高潮线，开放海水样本尽可能在低潮线以下采集。

样本处理与质控

使用无菌HDPE收集瓶采集表层水样，现场1小时内完成过滤（4%样本在采集后5小时内过滤）。水样通过0.22μm Sterivex-GX滤膜单元过滤，采用改良密封枪推动，滤膜经空气干燥后用100%乙醇保存。每个样点设置阴性对照（用瓶装水冲洗收集瓶后过滤200mL）。环境参数（水温和pH值）使用预校准的ExStik II传感器现场测定。

分子实验流程

在无PCR洁净实验室中，采用DNeasy Blood and Tissue Kit直接从滤膜提取DNA，并进行双标记扩增：

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  无脊椎动物：扩增线粒体COI基因~313bp片段，使用高简并性Leray-XT引物（正向：GGWACWRGWTGRACWITITAYCCYCC；反向：TAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA）
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  大型藻类：扩增18S rRNA基因V7高变区~133bp片段，使用Euka02引物（正向：TTTGTCTGSTTAATTSCG；反向：CACAGACCTGTTATTGC）

采用两步扩增 protocol：PCR1使用带悬垂接头的引物，PCR2使用索引引物添加Illumina测序接头。18S和COI提取物分别进行1:8和1:16稀释以降低抑制剂影响。热循环条件如表1所示。

测序与生物信息学分析

COI和18S文库分别在MiSeq（2×300bp）和MiniSeq（2×150bp）平台测序，包含10% PhiX spike-in。使用DADA2流程进行序列过滤、去噪和分类，分别基于MIDORI2 vGB259（COI）和SILVA v132（18S）数据库进行BLAST比对，设定98%序列一致性阈值。通过MEGAN6软件评估分类学分配，使用LCA算法（顶级百分比一致性设为1%）。所有数据分析在R v4.4.2环境中完成，使用phyloseq、vegan等包进行统计分析。

数据过滤与质控

采用去污染流程去除阴性对照中读数更高的类群，仅保留目标大型无脊椎动物和大型藻类门类（个体大于1mm）。剔除读数深度低于3000的样本（20个），通过稀释曲线验证采样充分性（图S5）。技术重复间相似性通过Jaccard和Bray相异度评估（图S6-S8），确认实验流程稳定性。

统计分析

使用混合模型分析α多样性（丰富度和Shannon指数）与潮位高度、区域、温度和pH的关系。采用PERMANOVA分析β多样性（Jaccard相异度）的空间差异，通过NMDS进行可视化。设置两个正交对比：1）低潮带与高潮带岩池对比；2）开放海水与岩池对比。同时分析常见物种（基于MarClim项目）在其已知生态栖息地的检测情况。

结果

测序产出与分类学鉴定

经过质控和去污染后，最终获得9,133,664条有效读数（平均每样本18,086条），其中COI标记2,697,852条（10,258条/样本），18S标记6,435,812条（26,594条/样本）。共鉴定出1026个目标类群（占过滤后数据的62.3%），涵盖655属、442科、19门（图2c）。75.6%的类群匹配到种级，84.2%至少到属级，91.6%至少到科级。COI标记检测到539个独有类群，18S标记检测到420个，仅7%（67个）类群被双标记共同检测（图2a）。开放海水样本检测到最多独有类群（233个），高潮带（56个）和低潮带（76个）较少，42%（428个）类群在所有三个潮位带均有检测（图2b）。

α多样性模式

丰富度模型显示样点（嵌套于区域内）贡献了35.8%的总方差。区域（χ2(4)=20.4, p<0.001）和潮位高度（χ2(2)=201.4, p<0.001）对丰富度具有极强影响（表S5）。具体而言，高潮带岩池丰富度显著低于低潮带（z(1)=-12.2, p<0.001），开放海水显著高于岩池（z(1)=8.95, p<0.001）（图3a）。丰富度与温度（χ2(1)=92.2, p<0.001；图3c）和pH（χ2(1)=13.6, p<0.001；图3e）呈负相关。

Shannon多样性模型中样点仅贡献13.1%的方差。区域间无显著差异（χ2(4,30)=3.4, p=0.494），但潮位高度存在中度证据差异（χ2(2465)=7.2, p=0.027）。开放海水Shannon多样性显著高于岩池（t(1,473)=2.52, p=0.012；图3b），而高潮带与低潮带间无差异（t(1,448)=-0.99, p=0.324）。温度（χ2(1134)=0.44, p=0.507；图3d）和pH（χ2(1359)=0.59, p=0.442；图3f）与Shannon多样性无显著关联。

β多样性空间格局

PERMANOVA显示所有空间尺度均存在显著群落差异。对于18S标记：区域解释11.98%变异（伪F(4,29)=3.50, p<0.001），样点解释27.29%（伪F(27,165)=5.4, p<0.001），潮位高度解释2.64%（伪F(2,35)=2.78, p<0.001），潮位高度与样点互作解释16.75%（伪F(35,165)=2.57, p<0.001）（表S7）。空间因子共同解释76.42%的群落变异。高潮带与低潮带群落组成差异显著（伪F(1,16)=2.59, p=0.002），开放海水与岩池差异极显著（伪F(1,19)=3.01, p<0.001）。

COI标记结果类似：区域解释9.24%变异（伪F(4,29)=2.78, p<0.001），样点解释25.48%（伪F(27,186)=4.47, p<0.001），潮位高度解释2.22%（伪F(2,35)=2.64, p<0.001），潮位高度与样点互作解释14.77%（伪F(35,186)=2.00, p<0.001）（表S8）。空间因子共同解释71.78%的变异。高潮带与低潮带（伪F(1,16)=2.92, p=0.001）、开放海水与岩池（伪F(1,19)=2.24, p<0.001）均存在显著差异。

NMDS可视化显示区域间存在聚类但存在重叠（图4a,c），潮位高度间无明显聚类（图4b,d）。COI（F(4,257)=6.51, p<0.001）和18S（F(4,237)=7.59, p<0.001）群落区域间离散度不均一，高潮带样本离散度最高（COI: F(2,259)=14.2, p<0.001；18S: F(2,239)=13.3, p<0.001）。相同潮位带样本间相异度（COI=0.77±0.004；18S=0.68±0.005）低于不同潮位带间，高潮带与开放海水样本相异度最高（COI=0.87±0.003；18S=0.84±0.004）（图5a,b）。

生态模式验证

典型高潮带类群检测比例从开放海水（7.7%）向高潮带（23.0%）递增（图6a），典型低潮带和开放水类群检测比例则递减（开放海水10.7%→高潮带5.0%）。低潮带类群在所有三个位置均占主导。北方类群检测比例随纬度升高而增加（西南英格兰53.3%→苏格兰89.9%），卢西塔尼亚类群呈相反趋势但南威尔士最高（28.5%）（图6b）。入侵类群在西南英格兰检测比例最高（11.4%），苏格兰和东北英格兰最低（<1%）。广布种比例与纬度无明确关系。

讨论

eDNA宏条形码的性能与变异性

双标记策略检测到广泛海洋类群，但标记间重叠有限（7%），反映了两者在分类覆盖度和数据库序列可用性方面的差异。非目标扩增占较大比例（37.7%），表明通用条形码特异性有限，但意外检测到大量微型浮游生物，为海岸带监测提供额外价值。技术重复与对应样本相似性较高，但场重复间高相异度可能源于岩池间固有生物变异和采样限制，建议后续研究通过视觉调查直接验证检测概率。

大空间尺度eDNA信号的更强分化

空间因子共同解释超过70%的群落变异，证实eDNA能有效捕捉潮间带空间影响。局域尺度检测重叠度高，潮位高度对群落组成的影响（18S: 2.64%；COI: 2.22%）远小于区域（18S: 11.98%；COI: 9.24%）和样点（18S: 27.29%；COI: 25.48%）效应，表明地理位置的区分度优于垂直潮位高度。这可能是潮汐周期内小尺度水体混合和DNA均质化所致：研究表明外源DNA可在1.5小时内扩散35米透射带。潮位高度效应在不同样点间变化显著，说明局域环境特征（如暴露度）可能通过改变物种分布范围驱动局部差异。

尽管差异较小，但局域尺度仍存在独特eDNA信号：相同潮位带样本相似度更高，海岸极端位置（高潮带与开放海水）相异度最大。这表明即使在小尺度（约10米）也能形成独特信号，但存在持续性相似元素。仅少数类群为高潮带和低潮带共有而不出现于开放海水，说明海岸-wide相似性主要源于高潮时潮水涌入的DNA持久性，而非岩池间直接传输。因此岩池独特信号可能在物理连接后仍能保持。

eDNA信号反映已知潮间带生态

eDNA检测与潮间带经典生态模式高度吻合：局域尺度物种丰富度从开放海水向高潮带递减，且随温度升高而下降。这反映了非生物胁迫梯度对局域生物多样性的塑造作用——高潮带因暴露时间长而面临脱水和温度波动压力，限制耐热性较差物种生存。虽然温度会加速eDNA降解，但DNA在20°C以上仍能持续至少24小时，且岩相潮间带大型类群多为固着生物，不可能在潮汐周期内迁移，因此丰富度下降更可能反映温暖区域胁迫增强导致的真实现象。Shannon多样性无显著模式则提示扩增读数与真实丰度间存在偏差，需采用PCR机制统计模型等进行校正。

区域尺度检测同样符合生物地理预期：冷亲和性北方物种检测率随纬度升高而增加（苏格兰达89.9%），暖亲和性卢西塔尼亚物种则相反。苏格兰高比例北方类群与其地质历史和更北纬度一致。西南英格兰入侵物种检测比例最高（11.4%），成功检测到钩凝菜（Asparagopsis armata）、 modest藤壶（Austrominius modestus）等非本地种。区域间检测存在适度重叠反映UK潮间带普遍存在广布类群，提示eDNA信号能真实反映系统生态。

对eDNA监测潮间带生物多样性的启示

基于eDNA信号在小尺度离散度较低的特性，建议根据监测目标制定尺度适宜的采样方案：研究小尺度生物多样性（如单一海岸微生境）时，应在最大物理隔离期（低潮）采样以识别独特生态信号；进行生物普查时需增加局域重复（如同岩池多样本）以减少假阴性；结合岩屑等介质可提升检测率。大尺度监测生物地理变化更具优势：无需区分局域区域时，高潮期开放海水采样能捕获更广DNA范围，提高效率。针对特定物种（如入侵种）需采用更特异引物和更高样点重复。总体而言，岩相海岸采样相比远海环境更具可操作性和成本效益。

结论

本研究通过多标记eDNA宏条形码方法，证明了该技术在高度连通海洋环境中表征沿海生物多样性和多尺度监测的潜力。跨潮位带和区域的群落差异与已知生态模式一致，表明eDNA方法能准确捕捉真实群落结构。eDNA信号更受地理位置而非垂直潮位高度的调控，反映小空间尺度DNA均质化效应，对生态学研究应用具有重要启示。建议根据具体监测目标采用尺度优化方案：大尺度评估优先选择高潮期开放海水采样以优化检测广度；局域模式研究宜采用低潮期岩池尺度采样。总体表明岸基eDNA方法可用于多尺度生态研究，监测超出本研究所限目标类群的广泛海洋生物多样性，但需通过视觉调查直接验证检测结果。