基于环境DNA（eDNA）宏条形码技术的欧洲绿蟾蜍保护监测与栖息地评估研究

本综述系统阐述了环境DNA（eDNA）宏条形码技术在两栖动物保护监测中的应用突破。研究以濒危物种欧洲绿蟾蜍（Bufotes viridis）为模型，通过eDNA技术成功实现 translocation（易地保护）效果评估、生物多样性普查和病原体（Bd）检测，揭示了牛群放牧与鸟类捕食对两栖动物的负向关联，为保护生物学提供了非侵入式监测新范式。

　　

1 引言

生物多样性保护对维持物种多样性具有关键作用，也是确保生态稳定和生态系统健康的核心要素。保护性易地（conservation translocations）作为现代保护工作的重要手段，在濒危物种管理中日益受到重视。成功的易地策略需要包含多个关键组成部分，包括利益相关方参与、繁殖计划建立、易地前栖息地评估、种群释放实施、长期监测以及适应性管理。两栖动物的易地与重引入项目在全球广泛开展，但小型或隐蔽物种的监测始终存在挑战。传统监测方法如鸣叫计数、卵/蝌蚪调查、灯光诱捕和标记重捕法等不仅劳动密集，而且存在检测概率低、季节性限制强以及可能干扰栖息地等问题。

环境DNA（eDNA）技术的出现为解决这些难题提供了新途径。eDNA是指从环境样品（如水、土壤或空气）中分离出的DNA，这些DNA来自目标物种遗留的细胞材料（如皮肤、毛发、粪便）。基于eDNA的物种监测方法已成功应用于多种隐蔽物种，如大冠蝾螈（Triturus cristatus）和胡拉彩蛙（Latonia nigriventer）。该技术不仅能减少与物种的直接接触，提高监测效率和准确性，结合高通量宏条形码技术还能同时评估保护物种及其生物相互作用，为管理者提供生态系统层面的数据。

欧洲绿蟾蜍（Bufotes viridis）在欧洲中部和东部广泛分布，但其在瑞典的种群数量在过去50年间急剧下降，已成为该国最受威胁的两栖动物。尽管保护努力包括栖息地恢复和大量蝌蚪放流，但成功建立繁殖种群的案例极少。这可能与生物因素（如捕食压力、种间竞争和壶菌感染）以及监测手段的不足有关。因此，开发基于eDNA宏条形码的监测方法对改善保护策略至关重要。

2 方法

2.1 易地实验采样

2021年5月，Nordens Ark基金会与卡尔马县委员会合作，将欧洲绿蟾蜍蝌蚪引入瑞典厄兰岛北岸的三个池塘。放流前确认这些池塘原本没有绿蟾蜍。为验证eDNA检测效果，在蝌蚪放流前3小时和放流后次日分别采集水样。每个池塘采集三重1升水样，使用经10%漂白水浸泡1小时的桶收集。每个采样点收集5升水，混合成复合样品以提高可靠性。采样人员佩戴无菌手套和口罩，使用5微米GF/0.8微米PES encapsulated滤器手动过滤，并用96%乙醇固定。

2.2 调查采样

2021年至2023年间，对厄兰岛和卡尔马县北部的31个淡水水体进行了eDNA采样，以开展两栖动物、鸟类和鱼类的一般性调查。5月份采集了所有31个位点的样本，其中6个位点在8月份再次采样，总共获得37份eDNA样本。5月采样选择与瑞典两栖动物主要繁殖季重合，以最大化检测概率。每个野外工作日收集一个阴性田间滤器对照，并针对每个水样检测蝙蝠蛙壶菌（Batrachochytrium dendrobatidis, Bd），使用MCP基因和qPCR协议，每个样本进行12次PCR重复。

2.3 阴性对照

为评估现场和实验室环境中的eDNA交叉污染，分析了阴性对照。每个采样日，通过过滤瓶装矿泉水处理阴性田间滤器样本。实验室中，每个提取环节都设置了阴性提取对照，包括阴性滤器提取对照和阴性试剂对照。每个PCR板加入4个无模板阴性对照重复。

2.4 DNA提取

DNA提取采用修改后的Qiagen DNAeasy血液和组织试剂盒协议，主要修改包括将蛋白酶K和缓冲液ATL直接加入滤器单元，允许在滤器单元中过夜裂解，并合并裂解液以提高DNA产量。

2.5 蝙蝠蛙壶菌qPCR

对疑似感染的站点进行了Bd筛查。2021年检测了8个站点，2022年春季检测了22个站点，秋季重新检测。实验室工作由NatureMetrics UK完成，使用TaqMan qPCR assay，每个样本制备12个重复。

2.6 宏条形码

文库制备和测序遵循已建立的12S宏条形码协议，采用两阶段PCR方法。使用非原生慈鲷（Maylandia zebra）作为阳性对照，分子级水作为阴性对照。第一阶段PCR使用12S-V5引物扩增106 bp片段，成功后通过凝胶电泳确认，并进行双尺寸选择清洁。第二阶段PCR连接预适配器、索引和Illumina适配器。

2.7 生物信息学

测序数据使用Illumina MiSeq Reporter软件解复用，使用fastp进行质量修剪。使用VSEARCH去除冗余序列，通过unoise算法全局去噪，以99%一致性定义ASV（扩增子序列变异）。使用VSEARCH去除嵌合序列，通过以97%一致性将去重复读数映射到去噪序列生成ASV表。使用BLAST对比UK脊椎动物参考数据库和NatureMetrics 12S数据库进行物种分类鉴定。

2.8 统计分析

检测概率计算为每个两栖物种在易地前后阳性检测次数除以重复样本数。使用广义线性模型（二项误差分布）评估检测概率变化。使用co-occur R包进行物种共存分析，评估物种对之间的共存概率与随机分布的零假设。采用多标准决策分析（MCDA）框架评估池塘适宜性，基于共现分析确定的四个关键因素（牛存在、苍鹭存在、九刺鱼存在和草食鸟类存在）进行加权评分。

3 结果

3.1 序列数据概要

易地实验样本产生3,140,171条双端读数，平均每个样本163,342条；调查样本产生3,029,794条读数，平均每个样本84,161条。PCR阴性对照均为阴性，阳性对照对斑马鱼（M. zebra）呈阳性。田间阴性对照基本为阴性，仅检测到较低水平的人类污染，不影响下游分析。

3.2 易地实验

共记录到4种两栖动物：冠北螈（Triturus cristatus）、普通蝾螈（Lissotriton vulgaris）、蟾蜍（Bufo bufo）和欧洲绿蟾蜍（Bufotes viridis）。此外还观察到鱼类（8种+1属）、鸟类（8种+5属）和哺乳动物（8种+1属）。易地前池塘的两栖动物多样性各异：池塘1和3各有2种两栖动物和4种及3种鱼类，池塘2则没有两栖动物或鱼类。绿蟾蜍的检测概率在放流后显著增加（p<0.01），但池塘间无显著差异（p=1）。其他两栖物种的检测概率变化不显著。

3.3 调查研究

在37次调查中，于22个站点检测到7种两栖动物和1个属，包括蟾蜍（Bufo bufo，17次）、欧洲绿蟾蜍（Bufotes viridis，1次）、普通蝾螈（Lissotriton vulgaris，7次）、沼泽蛙（Rana arvalis，4次）、达耳马提亚蛙（Rana dalmatina，1次）、临时蛙（Rana temporaria，1次）和冠北螈（Triturus cristatus，4次）。鸟类在31个调查点被发现，丰富度0-12（平均3.32）；鱼类在29个调查点检测到，丰富度0-7（平均2.30）；哺乳动物在24个调查点检测到，丰富度0-5（平均1.41）。Bd在五个池塘中检测到，2021年春季8个站点中有1个阳性（位于大陆），2022年春季5个站点阳性（2个在大陆，3个在厄兰岛人工池塘），2022年夏季所有站点均为阴性。

3.4 统计分析

两栖动物存在与Bd（p=0.85）、水温（p=0.28）和池塘面积（p=0.56）无显著关系。共存分析发现19对正相关和8对负相关。两栖动物中，普通蝾螈、蟾蜍和沼泽蛙与牛（Bos taurus）或苍鹭（Ardea cinerea）呈负相关。绿头鸭（Anas platyrhynchos）和灰鹤（Grus grus）与冠北螈正相关。MCDA分析显示6个池塘持续排名较低（更适宜），7个池塘因高牛或九刺鱼影响而排名较高（较不适宜）。

4 讨论

本研究成功证明eDNA宏条形码能有效检测欧洲绿蟾蜍，并区分其他两栖物种。该技术允许使用单一遗传标记对多类脊椎动物（两栖类、鸟类、鱼类和哺乳类）进行深度生物多样性评估。这不仅有助于跟踪易地种群动态，还能生成厄兰岛及周边地区的精细生物多样性信息。共存分析和MCDA揭示了生物互作模式，为未来保护策略提供了明确管理方向。

eDNA技术在保护管理中的优势明显。传统方法可能干扰脆弱生态系统或新建立种群，而eDNA提供了一种非侵入、高效且敏感的监测手段。其应用正不断扩大，包括解析种群动态、评估河流生态系统季节变化以及监测热带哺乳动物。

eDNA宏条形码在评估瑞典池塘生物多样性方面表现出高度有效性。传统方法耗时且可能侵入，而eDNA最小化对动物种群和栖息地的干扰，并能同时调查多个物种。研究发现牛群使用与两栖动物存在负相关，可能与物理干扰或植被改变有关。与九刺鱼的负关联可能源于竞争或捕食关系。

鸟类（无论是食鱼还是食草）可能通过不同方式影响两栖种群。食鱼鸟类可能通过捕食共享生境的鱼类间接影响两栖动物，而鸟类也可能直接捕食两栖类。草食鸟类则通过改变植被结构影响两栖动物的庇护和繁殖场所。

壶菌病（Bd）是全球两栖动物衰退的已知病原体。本研究首次在卡尔马县检测到Bd，所有阳性出现于春季（5月），秋季（8月）无检测。阳性池塘均为人工建造，可能挖掘设备污染导致传播。未发现Bd与两栖动物存在的显著关联，可能与Bd株系异质性或环境因素有关。

通过MCDA评估池塘适宜性，6个池塘持续表现出高适宜性，这些站点具有较高的鹤类和鸭类检测以及较低的牛或苍鹭出现。相反，7个池塘因高牛或九刺鱼影响而适宜性较低。这表明整合eDNA与MCDA能有效识别和优先选择栖息地用于未来保护努力。

作者贡献

M.S.撰写手稿；M.H.、M.S.、C.H.、R.B.、B.H.、D.H.、J.M.、S.N.、G.S.S.、M.N.、D.S.、A.F.、B.L.和K.F.参与数据获取、分析或解释；M.S.、M.H.和C.H.构思和设计研究；所有作者对最终版本提供意见。

致谢

本项目由瑞典农业大学（SLU）环境监测与评估计划、卡尔马CAD和厄兰体育渔民协会资助。感谢县委会、钓鱼协会及当地居民在场地访问中的协助。

利益冲突

作者Micaela Hellstr?m担任MIX Research Sweden AB的CEO。