儿童低级别胶质瘤的RNA-NGS与生物信息分析揭示分子景观及其临床意义

本综述系统分析了儿童低级别胶质瘤（pLGG）的分子特征，重点揭示了RAS-RAF-MAPK通路的关键驱动变异（如KIAA1549::BRAF融合和BRAF V600E突变），强调了多caller融合检测策略的重要性，为精准诊断和靶向治疗提供了关键依据。

　　

1 引言

儿童中枢神经系统（CNS）肿瘤是儿童中最常见的实体肿瘤，其中儿童低级别胶质瘤（pLGG）占40%以上。pLGG是一组异质性肿瘤，具有不同的发病位置、年龄、组织学亚型和临床行为。绝大多数pLGG的分子驱动因素是RAS–RAF–丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的遗传改变。儿童CNS肿瘤主要特征为致癌融合而非多重突变基因，且 invariably 涉及MAPK级联的激活。在发育过程中，大鼠肉瘤病毒家族蛋白/MAPK（RAS/MAPK）通路在皮层、中脑和小脑的形成中起重要作用。其在神经发生中的作用尤其与胶质瘤发病机制相关，因为胶质瘤的细胞起源现在被认为是神经干细胞或神经祖细胞而非有丝分裂后的胶质细胞。B-Raf原癌基因（BRAF）是pLGG中最常改变的基因，主要有两种改变：KIAA1549::BRAF融合和BRAF V600E致病性变异，两者均导致BRAF激酶的激活。除常见的pLGG改变外，还检测到影响RAS/MAPK信号的罕见改变，包括涉及FGFR1–3、NTRK1–3、RAF1、ALK和ROS1的改变。只有一小部分pLGG以一些间接影响RAS/MAPK通路的畸变为特征，例如MYB/MYBL1改变。MYB参与控制造血和其他祖细胞的增殖和分化，并与人类白血病和实体瘤中的原癌功能相关。MYBL1是MYB蛋白家族的成员。MYBL1不是已知的癌基因，但与原癌基因MYB密切相关。MYBL1参与RNA聚合酶II转录的正向调控。较少见的是，在pLGG中观察到异柠檬酸脱氢酶—IDH1,2的改变。IDH1 R132H突变仅在0.8%的pLGG中发现，且这些患者多为较大儿童/青少年。大部分儿童LGG以存在融合基因为特征。基因融合已知导致形成杂合蛋白，该蛋白要么组成性激活，要么表现出功能改变。最常见的例子是KIAA1549::BRAF融合，由Jones等人于2008年首次描述。KIAA1549::BRAF融合导致BRAF基因的串联重复，从而丢失BRAF的自抑制结构域并组成性激活其激酶结构域。KIAA1549::BRAF融合是毛细胞型星形细胞瘤（PA）的分子标志。自那时起，组学革命使我们能够发现许多其他驱动基因转录本与各种融合伙伴和基因组断点的融合，包括但不限于BRAF、RAF1、NTRK1/2/3、FGFR 1/2/3、ROS1、EGFR、ALK和PDGFRA。超过一半报道的独特融合是染色体内的（54%），例如上述的KIAA1549::BRAF融合，或大片段缺失，例如导致复发性FAM131B::BRAF融合的缺失。FGFR1激酶结构域重复（KDD FGFR1）可能是LGG中典型的另一种染色体内重排，由编码激酶结构域的基因部分约4.5 kb的内部串联重复组成。然而，由于检测染色体内融合的困难，其发生率可能被低估，并可能随着改进的检测算法而增加。分子分析，特别是下一代测序（NGS），对于确认诊断、指导治疗、提供预后信息以及根据肿瘤的分子特征招募患者参加篮子试验至关重要。然而，对从NGS获得的原始数据进行生物信息学分析可能具有挑战性，需要一系列方法。因此，进行了一项机构分子分析连同RNA-NGS研究，以揭示LGG相关的分子改变及其治疗意义。另一个目标是测试和比较不同的caller以检测融合基因、激酶结构域重复和剪接变异。

2 材料与方法

2.1 患者队列

为确定pLGG中的分子改变，我们分析了362例非NF1肿瘤（无已知1型神经纤维瘤病综合征的儿童肿瘤）。总体而言，94.47%（n=342/362）有足够的材料进行分子分析（具有阳性扩增）。本研究的pLGG队列包括362例非NF1患者，他们在2000年至2024年间在Motol大学医院接受随访和治疗。诊断时的中位年龄为8.16岁（范围0–20.2）。患者在门诊或住院基础上接受随访，并进行定期MRI成像。机构审查委员会批准了该研究，所有患者均根据我们的常规程序给予了知情同意。

2.2 组织病理学和免疫组织化学

选择最具代表性的肿瘤组织FFPE块，并进行连续切片免疫组织化学检查。使用以下一抗panel对LGG病例进行免疫组织化学研究：GFAP（1:1000，兔多克隆，Dako）、NeuN（1:1000，小鼠单克隆，克隆A60，Chemicon）、神经丝蛋白（1:50，小鼠单克隆，克隆2F11，Dako）、CD34（1:40，小鼠单克隆，克隆QBEnd-10，Dako）和Ki-67（1:150，小鼠单克隆，克隆MIB-1，Dako）。所有免疫组织化学反应均通过PolyDetector DAB HRP Brown（BioSB）免疫组织化学检测系统进行可视化。

2.3 分子检查

使用High Pure FFPET RNA Isolation Kit（Roche Diagnostics）从FFPE块中或使用Trizol（Invitrogen）从冰冻切片中纯化肿瘤RNA。为检测最常见的改变，我们使用了具有成本效益的算法，包括初始使用RT-PCR诊断或Sanger测序。进行PCR和Sanger测序以检查BRAF ex15第600密码子、FGFR1 ex12第546和656密码子以及FGFR1 ex14的热点突变，使用先前描述的引物对。使用2× PCRBIO HS Taq Mix Red（PCR Biosystems Ltd., London, UK）进行扩增。使用BigDye Terminator v 3.1化学（Life Technologies）和ABI PRISM 3500Dx遗传分析仪（Applied Biosystems）进行直接Sanger测序。使用Chromaslite 2.01（Technelysium, Pty Ltd., Brisbane, Australia）分析结果。使用RT-PCR检测预期的KIAA1549::BRAF融合，因为它更具成本效益且更省时。对于RT-PCR，我们使用了Badiali等人发表的引物。类似的方法用于检测BRAF基因的V600E热点变异，使用突变特异性PCR和Sanger测序。该方法用于后颅窝、脊髓、中线和中线通路肿瘤。对于半球LGG，在大多数情况下，我们直接进行NGS诊断，如同上述定位中PCR技术阴性结果的情况。在大多数病例中，也通过RT-PCR进行了DNET组织学诊断中FGFR1激酶结构域重复（KDD FGFR1）的分子检测。在阴性结果或半球定位的情况下，我们使用了NGS。使用FusionPlex Lung V1（14基因）或V2（17基因）panel，以及在某些情况下使用FusionPlex Pan Solid Tumor V2（137基因）、Oncology Research（75基因）和定制panel EMEA（57基因）（ArcherDX）制备NGS文库。最终扩增子随后在MiSeq（Illumina）仪器上进行测序。Archer FusionPlex即使在FFPE样本中也提供稳健性能。RNA提取、文库制备和并行测序按照制造商的建议进行。使用三个融合caller独立调用融合事件：Archer Analysis 6.0和/或7.0、Arriba和STAR-Fusion 24。使用内部工作流程调用剪接异构体。然后我们为新检测到的重排设计引物，并通过Sanger测序确认新的融合基因。

2.4 生物信息学方法

使用一个完善的分析流程对pLGG进行生物信息学分析，旨在检测与肿瘤发生相关的基因融合、激酶结构域重复和选择性剪接事件。

2.5 参考基因组和数据准备

对于转录组分析，我们使用了Gencode GTF文件版本45（GRCh38.p14）。原始测序数据首先使用Fastp进行处理，这是一个用于高通量测序数据质量控制和预处理的快速高效工具。为评估修剪后数据的全局质量，我们使用了FastQC。完整的生物信息学流程在支持信息中描述。

2.6 比对和融合检测

对于序列比对，我们使用STAR（Spliced Transcripts Alignment to a Reference）版本2.7.9a，这是一种广泛使用的RNA-seq比对器，将过滤后的FASTQ文件映射到GRCh38参考基因组。比对过程使用默认参数进行，并在BAM文件内部生成带有硬剪接的连接文件。对标准STAR设置进行了一项修改，调整了–chimScoreDropMax参数至30，这优化了嵌合读段的比对——那些映射到基因组多个位置或具有融合基因特征的读段。此调整旨在增强基因融合的检测，这是pLGG的一个标志。使用Arriba（版本2.4）以及STAR-Fusion进行融合基因检测，两者都是检测RNA-seq数据中融合事件的流行工具。运行Arriba时使用了修改的参数-E 0.8，该参数指定了考虑一个融合事件所需的最小预期支持读段数。此阈值通过最小化假阳性确保更高的特异性，特别是在存在低丰度融合转录本的情况下。使用像0.8这样的严格阈值对于罕见融合检测至关重要，因为它减少了非特异性比对的噪声，同时保持了敏感性。两种融合工具都以检测驱动肿瘤发生的临床相关融合的敏感性而闻名。此外，我们使用默认参数运行STAR-Fusion进行融合基因检测。虽然两种工具识别相似的融合事件，但使用多个融合caller允许交叉验证并确保结果的稳健性。

2.7 剪接事件和异构体检测

除基因融合外，我们还试图识别较小的遗传事件，例如外显子跳跃和选择性剪接模式，这些通常与癌症特异性异构体相关。这些改变通常难以用常规的基于外显子的方法检测，但可以通过分析嵌合连接来识别。为此，我们开发了一个内部工作流程，旨在通过识别外显子之间的嵌合连接（代表基因组的跳跃区域）来检测这些剪接事件。

3 结果

为确定我们pLGG队列中分子改变的真实频率，我们分析了342例材料质量足以进行分子分析的肿瘤。在我们的LGG患者组中，我们能够通过结合RT-PCR、Sanger测序和NGS技术在318/342例患者（92.9%）中检测到分子改变：KIAA1549::BRAF（n=143/342, 41.81%），BRAF p.V600E（n=59/342, 17.25%）合计占非NF1 pLGG的59%。罕见的BRAF改变、非经典BRAF融合（n=14/342, 4.09%）和V600E以外的BRAF SNV（n=7/342, 2%）占额外的6.14%。下一个最常见的改变是影响受体酪氨酸激酶的改变—主要是FGFR1–3，包括FGFR1::TACC1（n=9）、KDD FGFR1（n=17）、FGFR1中的热点突变（n=13）、FGFR2融合（n=12）以及罕见的FGFR3::TACC3融合（n=3）。FGFR改变的LGG亚组占所研究pLGG的16.08%。其他酪氨酸激酶重排如ALK、ROS1、NTRK1–3和RAF1罕见（n=18, 5.26%）。在四例患者中检测到KRAS基因的SNV，在一例患者中检测到PDGFRA基因的突变。非RAS/MAPK改变如MYB（n=3）或MYBL1（n=1）和IDH1 SNV（n=11/342, 3.2%）在我们队列的一小部分中检测到。

3.1 BRAF融合

pLGG中最常见的BRAF融合是KIAA1549::BRAF。在我们的队列中，我们检测到九种不同的KIAA1549::BRAF外显子-外显子连接，包括16–9、15–9、16–11、15–11、13–11、13–9、10–9、17–11和19–9，所有这些都导致BRAF基因调控结构域的丢失。最常见的融合是16–9（n=71），其次是15–9（n=43），第三是16–11（n=10）。其他融合罕见：13–11（n=6）、15–11（n=6）、10–9（n=4）、13–9（n=1）、17–11（n=1）以及最后的19–9（n=1）。所有10–9融合均在脊髓LGG中检测到，类似地，大多数KIAA1549外显子13融合也在脊髓LGG患者中检测到（n=4）。接下来的两个KIAA1549::BRAF融合，13–11，见于小脑LGG，一个见于视通路肿瘤。典型的16–9融合大多数见于后颅窝区域，类似于16–11融合。KIAA1549::BRAF阳性肿瘤患者年龄较小（中位年龄5岁），主要位于后颅窝，组织学上主要为毛细胞型星形细胞瘤。我们检测到13种KIAA1549以外的BRAF基因N端伙伴（BCAS1、FAM131B、GNAI1、BCAS1、GTF21、MKRN1、NRF1、NUDCD3、PAG1、PRKAR2B、RNF130、TAX1BP1和一个新的EPHB2）。大多数融合断点发生在BRAF的外显子9上，并且在所有融合中，位于前六个外显子的抑制性调控结构域被融合破坏。一半的非经典BRAF融合见于半球LGG。

3.2 BRAF SNV

LGG组中第二常见的改变是BRAF V600E突变（n=59/342, 17.25%）。BRAF V600E肿瘤更常见于年龄较大的患者（中位年龄10.14岁），并且更可能位于半球区域。然而，与KIAA1549::BRAF相比，它们在小脑中罕见，并且包括一系列组织学亚型。V600E以外的BRAF基因SNV罕见。BRAF T599dup突变（n=3）表示在BRAF蛋白的蛋白激酶中插入了重复的氨基酸苏氨酸。下一个罕见的BRAF SNV是G469A，这是BRAF蛋白激酶结构域内的一个热点突变。

3.3 RAS/MAPK的其他直接成员

另外2.34%（n=8）的病例包含RAS/MAPK通路其他直接成员的改变，包括四个KRAS SNV和四个RAF1融合（SRGAP3::RAF1、QKI::RAF1和FCHCD2::RAF1）。KRAS是RAS/MAPK通路中的上游分子。关于pLGG中KRAS突变频率的报告范围从1%–5%，主要出现在毛细胞型星形细胞瘤中。四例KRAS突变患者中的两例患有半球神经节胶质瘤，一例患有半球PA，最后一例患有脊髓DLGNT（弥漫性软脑膜胶质神经元肿瘤）。RAF1融合包含完整的RAF1激酶结构域（由外显子10–17编码），在功能上类似于BRAF融合。四例RAF1融合患者中的三例患有PA，一例患者患有胶质神经元肿瘤。

3.4 FGFR1-3改变

FGFR1-3是受体酪氨酸激酶（RTK），通过激活其膜内酪氨酸激酶结构域（TKD）在信号转导中起关键作用。FGFR1是pLGG中第二常见的改变基因。pLGG中的FGFR1改变通过三种机制产生：FGFR1突变、FGFR1::TACC1融合和FGFR1激酶结构域重复。在54例患者（16.8%）中检测到FGFR1-3改变，中位年龄为8.69岁。在FGFR1改变中，KDD FGFR1是DNET诊断的典型，是最常见的（n=17），中位年龄为6.78岁。在九例患者中检测到融合基因FGFR1::TACC1，中位年龄为10.4岁。在13例患者中观察到FGFR1热点突变（FGFR1 K656E或D, N546 D或K），中位年龄为10岁。在大多数情况下，一种因果改变对pLGG是典型的，除了FGFR1 SNP，我们在13例患者中的3例中发现了额外的FGFR1 SNV或与PIK3CA基因SNV（E545K或H1047R）的组合。在我们的pLGG队列中，我们观察到相对较高频率的FGFR2融合基因（n=12），即FGFR2::INA（n=5）、FGFR2::KIAA1598（n=3）、FGFR2::ZCCHC24（n=2）、FGFR2::CTNNA3（n=1）和FGFR2::PASD1（n=1）。FGFR2融合患者的中位年龄为6.84岁。所有FGFR2重排患者的肿瘤均位于半球。在三例患者中检测到FGFR3::TACC3融合基因，这在pLGG人群中通常罕见。所有均位于半球。

3.5 其他RTK融合

其他RTK中的融合在pLGG中罕见（5.26%），中位年龄为5.45岁。ALK、ROS1、NTRK和MET融合是婴儿HGG的典型特征，并且也在各种儿童胶质瘤中发现。NTRK1-3基因（n=9）在RTK融合中丰度最高：NACC::NTRK2、CLIP2::NTRK2、SPTAN1::NTRK2、KANK1::NTRK2、PDE4DIP::NTRK1、KIF21B::NTRK1、ETV6::NTRK3以及最后的BCR::NTRK3。ALK融合包括ALK::GIGYF2、PPP1CB::ALK和EML4::ALK。所有ALK阳性pLGG均位于半球，与其他位于不同CNS区域的RTK融合形成对比。矛盾的是，除一例外，所有ALK融合LGG都不是婴儿LGG。其他两例ALK融合阳性患者年龄超过10岁。ROS1融合由GOPC1::ROS1和GIT2::ROS1代表。第一例是先天性半球肿瘤，第二例是一名3岁女孩的中线肿瘤。

3.6 IDH SNV

IDH1突变在成人低级别胶质瘤中常见。在pLGG中，IDH1突变罕见，仅占病例的3.2%。在11例患者中观察到IDH1热点突变（R132H、R132C、R132G、R132S）。IDH SNV患者在儿童晚期诊断（中位年龄17.13岁），最年轻患者在12.6岁诊断。IDH1变体之间的中位年龄没有差异。

3.7 RNA-NGS分析

通过RNA NGS分析的115例pLGG病例中，在88例（74.1%）中鉴定出重排。使用三种生物信息学工具进行融合基因检测：Archer、Arriba和STAR-Fusion。其中，STAR-Fusion表现出最低的敏感性，仅在59/88例融合阳性病例（67%）中检测到重排。相比之下，Arriba识别了86/88例重排（97.77%），而Archer检测到78/88例重排（88.6%）。这些发现突出了融合caller之间检测效率的差异，强调了在分子诊断中选择工具的重要性。FGFR1基因激酶结构域的重复（KDD FGFR1）被证明是最具挑战性的，只能使用Arriba caller检测到。此外，使用多个caller成功检测了BRAF重排，包括KIAA1549::BRAF和非KIAA BRAF融合。对于两个低质量RNA的LGG，Archer软件未能检测到KIAA1549::BRAF融合，但Arriba caller成功了。类似地，对于罕见的非KIAA BRAF融合基因，我们能够使用Arriba和STAR-Fusion caller检测EPHB2::BRAF和PAG1::BRAF融合。另一个NRF1::BRAF融合再次仅由Arriba caller检测到。另一方面，MKRN1::BRAF融合基因未被Arriba caller或STAR-Fusion检测到，但被Archer检测到。Archer分析的结果通过RT-PCR和随后的Sanger测序得到确认。Archer FusionPlex试剂盒基于扩增子NGS原理工作，可成功用于质量较低的存档FFPE材料。我们能够在诊断33年后在一例复发性PA患者中证明存在外显子16–9的KIAA1549::BRAF融合。使用Archer FusionPlex Lung，我们随后能够在33年历史的存档FFPE材料中证明相同的融合，但由于QC分数非常低，该融合仅被Arriba caller检测到。这个案例再次很好地证明，即使在低质量材料中，也需要caller组合以提供更好的检测因果融合基因的机会。几个基因的截短，例如MYBL1截短重排，也仅被Arriba检测到。相比之下，与Archer相比，Arriba和STAR-Fusion更常漏检致癌基因变体，例如EGFRvIII和MET外显子14跳跃。为检测这些变化，建议使用额外的caller来检测剪接变体。维恩图示意性地总结了所使用的各个caller的成功率。所有不一致的重排均通过RT-PCR随后进行Sanger测序得到确认。类似地，当我们首次设计引物时，确认了新的或罕见的融合。RT-PCR后，最终产物通过Sanger测序验证。

4 讨论

随着最近第5版WHO CNS肿瘤分类强调分子诊断的作用，融合基因的检测已成为儿童CNS肿瘤的重要诊断标志物。基于我们在LGG分子诊断方面的经验，我们开发了一种具有成本效益的算法，该算法结合了针对性测试（针对最常见改变的RT-PCR或Sanger测序）和阴性病例中的NGS多调用。我们的研究结果证实，pLGG中的大多数遗传事件集中在MAPK信号通路上。最普遍的是KIAA1549::BRAF融合（41.8%）、BRAF V600E突变（17.25%）和FGFR1改变（16.8%）。RNA测序揭示了九种不同的KIAA1549::BRAF外显子-外显子连接以及15种罕见或新的BRAF融合，包括7号染色体上的染色体内重排（NUCD3::BRAF、MKRN1::BRAF、FAM131B::BRAF、TAX1BP1::BRAF、PRKAR2B::BRAF、NRF1::BRAF）和易位衍生融合，如RNF130::BRAF [t(5;7)]、BCAS1::BRAF [t(7;20)]、PAG1::BRAF [t(7;8)]和GTF21::BRAF [t(7;7)]。值得注意的是，我们首次在儿童脑肿瘤中报道了EPHB2::BRAF融合。EPHB2基因编码Eph受体家族受体酪氨酸激酶的成员，该家族由N端配体结合结构域、跨膜区域和细胞内激酶结构域组成。EPHB2先前已被描述为与其他伙伴的融合，例如NTRK1、PDZD4或NBPF3、ASAP3或INTS11。与其他BRAF融合类似，产生的蛋白EPHB2::BRAF缺乏N端抑制结构域，导致BRAF激酶组成性活化和MEK/ERK信号增强。BRAF融合的检测需要结合使用多个生物信息学caller，因为较低的转录本表达经常导致假阴性。Arriba被证明最可靠，仅漏检47例融合阳性病例中的2例，而Archer漏检4例，STAR-Fusion漏检14例。失败发生在染色体内和易位衍生融合中，包括经典的KIAA1549::BRAF，这强调了多caller策略的重要性。即使是经典的融合如KIAA1549::BRAF也可能难以检测，尤其是在次优样本中。确定融合基因检测的最佳截止值具有挑战性，尤其是在处理具有降解RNA的次优FFPE样本时。QC由Archer Analysis确定，因此GSP2对照的独特RNA起始位点数必须大于10。在我们的pLGG患者队列中，我们甚至在10例样本QC失败的病例中通过Archer Analysis检测到融合基因（7例KIAA1549::BRAF，1例GNAI1::BRAF，1例NACC2::NTRK2和1例PPP1CB::ALK）。这一事实清楚地表明了使用额外caller的重要性，因为在所有病例中，融合基因至少被Arriba caller和RT-PCR检测到。除融合外，我们还检测到罕见的BRAF SNV。除V600E外，大约一半发生在半球肿瘤中，我们观察到T599dup（n=3），它增强了MEK/ERK磷酸化，以及G469A，这是一个已知的独立于RAS激活MAPK通路的热点突变。我们队列中第二常见的改变是FGFR融合/S