液体活检中单颗粒荧光染色信号放大技术：循环肿瘤细胞与细胞外囊泡的突破性研究

本文推荐了一种基于酪胺信号放大（TSA）的免疫荧光（IF）染色策略，用于增强液体活检中单颗粒（包括循环肿瘤细胞（CTCs）和细胞外囊泡（EVs））的检测灵敏度。该方法通过HRP（Horseradish Peroxidase）酶促反应激活荧光酪胺探针，实现信号放大（>6倍）、稳定性提升及动态范围扩展（~3倍），支持多重染色并适用于胶质母细胞瘤（GBM）等癌症的临床样本分析，为低丰度标志物检测提供了高效、经济的解决方案。

　　

摘要

免疫荧光（IF）染色是分析单个体外囊泡（EVs）和识别具有特定功能亚群的便捷且经济的方法，但其应用受到囊泡携带低丰度标志物产生的微弱不稳定信号的挑战。本研究开发了一种基于酪胺信号放大（TSA）的IF策略，采用酪胺探针进行信号增强。该技术首先在胶质母细胞瘤循环肿瘤细胞（GBM CTCs）上验证，并与使用荧光标记一抗和二抗的传统方法进行系统比较。随后，该方法被调整、测试和优化，用于从亲代GBM CTCs分离的单EVs的多重荧光染色。结果表明，开发的TSA方法可实现单EVs的特异性染色，与传统荧光方法相比，具有放大（>6倍）的信号强度、更稳定的信号和更宽（~3倍）的信号动态范围优势。开发的协议还支持通过在不同染色颜色之间加入淬灭缓冲液实现多重染色。最后，该协议展示了其对来自GBM患者血浆样本的CTCs和EVs的适用性，并可轻松适应其他癌症或目标蛋白。

1 引言

单颗粒免疫荧光（IF）染色在生物样品中面临重大挑战，包括其固有的异质性组成、通常微弱的信号、对缓冲条件的敏感性、适当样品固定的必要性，以及非特异性结合（NSB）和高背景信号的可能性。这些挑战在单细胞外囊泡（EVs）的情况下尤为突出，其生物样品的复杂性加上相当大的尺寸异质性（直径40–2000 nm）和许多囊泡的非常小的尺寸（<300–400 nm），大多数低于光的衍射极限。EVs的如此小的表面积允许用于染色的靶标数量有限，导致极其微弱的信号，通常与背景水平无法区分或在非常短的时间帧内消失。

尽管存在这些障碍，单EVs分析由于其解决囊泡异质性的关键作用，因此识别可能负责特定生物学功能的囊泡亚群，正获得越来越多的关注和兴趣。这类信息无法通过使用批量分析方法获得，因为此类方法只能分析平均属性。考虑到单囊泡分析的重要性，但考虑到这些生物颗粒有限 cargo 带来的挑战，最近的努力集中在精心开发和/或优化技术以放大信号和/或提高检测灵敏度/检测限。在所有可用于在单颗粒水平表征EVs的方法中，IF代表了一种高效、方便和多功能的方法来可视化囊泡上的 cargo，对其进行半定量并在各种样品之间进行比较。该方法还具有成本有限以及自动化和多重化的可能性优势。

为了克服单EV分析中的上述挑战，并考虑到IF方法的优势和挑战，在这项工作中，我们专注于开发一种基于IF染色的信号放大策略。具体来说，开发的协议基于酪胺信号放大（TSA），本文命名为TSA，因为它利用称为酪胺探针的小报告分子来获得信号增强。简而言之，TSA方法依赖于与二抗偶联的辣根过氧化物酶（HRP）来酶促转化非反应性酪胺荧光探针为反应形式。一旦激活，荧光酪胺共价结合在靶向一抗的蛋白质表位及其周围的酪氨酸残基上。由于单个HRP偶联的二抗可以激活多个酪胺探针，与传统使用直接标记荧光抗体的染色方法相比，荧光信号显著放大。这种方法改善了对低丰度标志物的检测，提供了增加的信噪比（SNR）测量。此外，与使用荧光标记一抗或二抗的传统染色方法相比，TSA技术表现出最小的非特异性染色、更宽的信号动态范围和随时间增强的信号稳定性，同时保持与其他技术相当的成本。所有这些特征在染色单EVs的背景下具有关键重要性，考虑到囊泡携带的许多癌症特异性标志物的非常低的丰度及其通常非常差的信号稳定性。

尽管TSA方法已在几种情况下用于细胞染色，但其在循环肿瘤细胞（CTCs）中的具体应用有限，在EVs分析背景下甚至更少。胶质母细胞瘤是最常见和恶性的脑肿瘤形式，预后极差（5年生存率<5%），是我们实验室的主要焦点，其在分析来自GBM患者的CTCs和EVs方面有着悠久的历史。现有的关于TSA分析的文献主要集中于全组织染色，使用固定在玻璃载玻片上的石蜡包埋切片，提供结构完整性以及充足的蛋白质固定。此外，专注于CTCs的工作大多集中在其他癌症类型，如前列腺癌、结直肠癌和腺癌。Tubbs等人开发了一种用于在GBM癌细胞上染色单一标志物的TSA-荧光原位杂交（TSA-FISH）方法，而其他一些研究利用类似的方法，基于商业可用试剂盒，用于组织染色而不是分析来自GBM患者的单CTCs。据我们所知，当前文献中明显缺乏对TSA技术与传统染色方法在单CTC分析中，特别是在GBM CTCs领域的系统和全面探索。在我们合作者Brian Nahed博士领导的一项先前工作中，我们已经表明特定的抗体混合物可以使用直接荧光染色区分GBM CTCs与白细胞（WBC）。基于这项工作，在本研究中，我们首先在CTCs上验证开发的TSA协议。具体来说，我们证明了使用相同的GBM CTC抗体混合物，现在集成到基于酪胺的信号增强模式中，染色和区分GBM CTCs与WBC的可能性。此外，我们提供了与传统染色方法的系统比较，包括直接和二抗染色，揭示了TSA方法在复杂单CTC分析中的功效和潜在优势。

此后，我们展示了开发的TSA方法用于从上述亲代GBM CTCs分离的单EVs染色的验证和应用。少数使用TSA方法的现有报告主要将其应用于批量染色EVs，只有非常有限的实例应用此方法标记单囊泡。迄今为止，只有三项研究，由Nguyen等人、Chen等人和Reynolds等人进行，报道了使用酪胺放大策略进行单EVs的荧光标记。然而，这些研究不包括信号多重化，并且对该方法的验证有限。在本研究中，我们专注于开发一种专门为单囊泡染色量身定制并可多重化的TSA协议。所提出的方法具有成本效益，因为它可以在不需要购买昂贵的商业试剂盒（如Opal试剂盒）的情况下复制。此外，我们旨在提供开发的单EV TSA方法与使用荧光标记一抗和二抗的传统方法之间的系统比较。这种比较分析旨在阐明每种技术的各自优缺点，使研究人员能够根据其特定应用需求和独特需求在染色单个EVs时做出明智决策。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

使用了多种抗体、荧光探针、缓冲液和化学试剂，包括磷酸盐缓冲盐水（PBS）、Alexa Fluor酪胺试剂、各种一抗和二抗（如抗A2B5、抗CD11c、抗EGFR等）、DAPI以及封片剂等，采购自ThermoFisher Scientific、Millipore Sigma、Perkin Elmer、Jackson Laboratory、Novus Biological、Abcam、BioLegend和Santa-Cruz Bio等供应商。

2.2 胶质母细胞瘤原代细胞培养

使用了两种悬浮胶质母细胞瘤细胞系：MGG72（源自患者原发肿瘤的GBM干细胞样细胞系，简称为GBM1）和从GBM患者血液中分离的CTCs建立的细胞系（简称为GBM2）。使用特定的培养基和补充剂进行培养。

2.3 GBM原代细胞铺板

通过离心收集细胞，重悬于PBS，计数后使用多聚甲醛（PFA）固定，并通过细胞离心（cytospin）将特定数量的细胞铺在TruBond380粘附玻璃载玻片上，进一步固定后储存于-80°C直至使用。

2.4 细胞外囊泡分离

从GBM1和GBM2细胞条件培养基中分离EVs。使用离心、浓缩和尺寸排阻色谱（SEC）的组合进行纯化和分离。使用Izon qEVoriginal 70 nm Gen2色谱柱按照制造商推荐的方案进行分离。

2.5 纳米颗粒跟踪分析

使用Nanosight 3000（Malvern Instruments）和ViewSizer 3000（HORIBA Scientific）通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）表征分离EV样品的尺寸和浓度。

2.6 蛋白质免疫印迹

使用RIPA裂解缓冲液裂解GBM2亲代CTC细胞 pellet 和分离的EVs，通过SDS-PAGE和Western Blot分析蛋白质表达，使用HSP70、CD63、CD9等抗体。

2.7 酶联免疫吸附测定

使用商业ELISA试剂盒（RayBiotech for EGFR, Aviva Systems Biology for CD9）检测EVs上的蛋白质水平。

2.8 透射电子显微镜

将EV悬浮液应用于Formvar/碳包被的镍网格上，吸附后用水冲洗，并用醋酸铀酰对比染色，使用JEOL JEM 1011透射电子显微镜在80 kV下检查。

2.9 EVs的dSTORM成像

使用ONI的dSTORM Nanoimager系统和EV Protein Profiler试剂盒研究EVs的四跨膜蛋白（CD9、CD63和CD81）组成。EVs被固定到功能化的ONI微流控芯片上，使用捕获抗体 cocktail，然后使用荧光抗体（CD9-AF488, CD63-AF555, CD81-AF630）进行染色，并在ONI显微镜下成像。

2.10 EVs在玻璃载玻片上的固定

对于本研究中的染色实验，EVs主要通过 overnight adsorption 固定在TruBond380粘附玻璃载玻片上。初步验证实验中也使用了其他策略：吸附到Poly-L-Lysine（PLL）玻璃载玻片上以及使用细胞离心固定在PLL或TB380玻璃载玻片上。

2.11 CTCs和EVs的荧光染色

使用了三种不同的策略：直接染色（DS）、一抗+二抗染色（PSS）和TSA染色（TSA）。所有准备步骤、洗涤步骤、洗涤溶液/抗体的孵育时间以及抗体浓度保持不变。唯一区别在于使用的抗体类型：DS仅使用荧光标记的一抗；PSS使用未标记的一抗+荧光标记的二抗；TSA使用未标记的一抗+HRP偶联的二抗+荧光TSA探针。完整的TSA染色方案在支持信息中描述。

2.12 GBM CTCs和EVs的成像

染色的GBM细胞/CTCs使用Akoya Biosciences的Vectra3自动定量宽场显微镜（40×空气物镜，NA=0.95）和Zeiss的LMS 710共聚焦显微镜成像。EVs仅使用Zeiss LMS 710共聚焦显微镜和高倍油浸物镜（63×油镜，NA=1.4）成像。

2.13 GBM CTCs和EVs的图像分析

对于细胞/CTCs，获取的图像使用inForm软件进行光谱分离，以消除获取的荧光通道之间的可能串扰。随后使用HALO软件（Indica Labs, HighPlex FL v.4.1.3模块）处理分离后的图像，通过用户训练的分类器区分CTCs和WBCs，并使用分割算法检测和量化标志物表达。

获取的EV图像使用Zeiss ZEN Blue和Fiji软件处理。ZEN Blue用于通过基于强度直方图的自动分割、强度阈值设置（检测对照中少于10个颗粒）、物体形态分离和启用“填充孔洞”功能来计算单EVs的FL强度值。Fiji软件主要用于快速EV计数/FOV以及确定蛋白质/EV可检测的最小数量的检测限（LOD）。

3 结果

3.1 TSA染色方法在单循环肿瘤细胞上的比较与验证

为了验证开发的TSA染色技术，从两个GBM细胞系（GBM1和GBM2）获取了EVs和CTCs。如图1A所述，细胞通过300×g离心5分钟收集，并重悬于PBS两次。EVs通过离心（300×g 5分钟 + 2000×g 10分钟）、浓缩（Amicon Ultra 15 mL Filters）和SEC（Izon qEV columns, 2nd generation）分离。分离后，细胞通过细胞离心和PFA固定固定在TB380玻璃载玻片上，而EVs通过 overnight incubation 吸附到玻璃载玻片上，除非另有说明。

固定的细胞和/或EVs然后使用开发的TSA染色技术在单颗粒水平进行染色，或使用直接染色（DS）或一抗+二抗染色（PSS）进行比较。图1B显示了这三种荧光策略的示意图，详细描述在材料与方法部分和支持信息中提供。

TSA技术首先在亲代GBM循环肿瘤细胞和白细胞（WBC）上验证并与另两种技术（DS和PSS）进行比较。为了显示技术的特异性和荧光信号的放大，从其中一个细胞系（GBM1）分离的GBM细胞首先以1:1的比例与从健康供者通过密度梯度分离的WBC一起铺在载玻片上。铺板的细胞使用DS、PSS和TSA染色。表皮生长因子受体（EGFR）被用作目标标志物，因其在这些GBM细胞表面已知过表达，并使用绿色AF488标记的抗体或AF488-酪胺探针（TSA-AF488）靶向。如图2A可见，EGFR绿色荧光信号仅在GBM细胞上检测到（较大的细胞，较大的DAPI核，一些用绿色箭头指出），而不在WBC上（较小的细胞，较小的DAPI，一些用红色箭头指出），表明三种技术的特异性，包括开发的TSA方法。绿色EGFR通道的分视图显示与固定在同一载玻片上的WBC的最小至无交叉反应性。此外，图像清楚地表明TSA技术的EGFR荧光信号比DS和PSS更强。

当分析单GBM细胞上EGFR的强度（计算为整个细胞表面的积分强度）时，结果显示TSA信号的分布显著大于其他两种策略（TSA-PSS和TSA-DS的p < 0.001）。这一趋势通过使用两个独立的成像仪器（Vectra3宽场显微镜和Zeiss LSM 710共聚焦显微镜）以及比较所有方法和系统的动态范围得到确认。如图2B中的表格所示，动态范围之间的比率（计算为PSS到DS和TSA到PSS）在两个成像系统之间相似（PSS到DS为1.4和2.6，TSA到PSS为27.7和25.5），表明结果和荧光放大因子的一致性。

在一个细胞系上验证后，TSA技术应用于两个GBM细胞系，并测试了通常在GBM细胞上表达的两种表面蛋白：EGFR和Met。对于此分析和比较，考虑了归一化的平均强度值。这些归一化值通过将总细胞积分强度除以其二维面积和采集时间得出，旨在补偿细胞尺寸和图像采集时间的变化。如图2C所示，两个细胞系都表达了分析的标志物，GBM1细胞上Met的过表达显著高于GBM2 CTCs（p < 0.0001），并且与GBM1的EGFR相比（p < 0.0001）。Met在GBM2 CTCs上的表达略高于EGFR（平均强度=33.9 a.u. vs 21.1 a.u.），但总体差异不显著（p = 0.35）。GBM1和GBM2之间的EGFR平均细胞强度未检测到显著差异（p = 0.96），尽管GBM1细胞显示出FL信号的动态范围增加。此外，每个视野（FOV）中表达EGFR的GBM1细胞数量多于GBM2 CTCs。最后，研究了三种染色策略下EGFR荧光信号（在玻璃和盖玻片表面之间使用PBS和封片剂）在5分钟时间段内的稳定性。对于这些实验，将固定有染色CTCs的基底连续用激光激发5分钟，并分别在时间0、1、3和5分钟后捕获快照图像。如图2D和图S1所示，在整个激光激发期间，荧光EGFR信号相当稳定，与使用的染色方法无关。因此，即使是DS和PSS中检测到的最低信号也至少稳定5分钟。此外，无论使用PBS还是封片剂来安装载玻片和盖玻片并作为成像介质，这种趋势都是有效的。

在初步验证单一染色颜色后，研究了使用开发的TSA协议进行单细胞多重染色的可能性。为此，最初使用双重TSA染色来区分不同的细胞类型，特别是GBM CTCs和WBCs，然后用于显示在同一肿瘤细胞上共定位多个标志物的可能性。

为了实现第一个目标，将GBM2 CTCs spike 到健康WBC样品中，并使用通常在胶质母细胞瘤上（过）表达和/或更特异的标志物组合（根据文献和我们先前的研究）进行染色。这些标志物，包括Sox2、Tubulin、EGFR、A2B5和Met，组合在一个称为STEAM的cocktail中，并使用TSA-AF488探针进行绿色染色。对于WBC识别，使用CD11c和CD45的组合，用TSA-AF594探针进行红色标记染色。DAPI用于染色和识别细胞核，使染色成为三重。然而，由于其染色不包括TSA探针，本文中我们将TSA协议称为双重染色。

如图3A可见，对应于STEAM cocktail的绿色信号仅在GBM CTCs上检测到，而红色信号对WBC特异。这些发现与我们先前研究的结果一致，显示了使用这两种抗体混合物成功区分GBM CTCs和WBC。然而，虽然我们先前的工作通过标志物的直接荧光染色得出了这些结论，但本研究使用开发的TSA协议再次证实了相同的结果。当尝试在同一细胞类型（GBM2 CTCs）上进行多重染色时，将STEAM-AF488抗体混合物与CD9-CD81抗体混合物（使用TSA-AF594探针进行红色标记）组合（图3B）。CD9和CD81是通常在EVs表面富集的四跨膜蛋白。在这种情况下，我们研究了它们在亲代GBM2 CTCs表面存在的可能性。如图3B所示，两种染色颜色在GBM CTCs上检测到，大多数细胞仅对STEAM或CD9-CD81标志物呈单阳性。此外，如图3B右侧图像可见，当仅对GBM2 CTCs进行CD9-CD81染色（无STEAM）时，似乎很少有循环肿瘤细胞在其表面表达CD9和CD81，与STEAM相比。

在这里，我们想强调，在第一和第二种染色颜色之间使用淬灭缓冲液是不需要的，因为即使没有这种缓冲液，信号对CTCs和WBCs也是特异的。此外，由于一些靶向标志物是细胞内的（Sox2、Tubulin），在染色协议中包括了少量Triton X-100（0.3%），特别是在TNB抗体稀释缓冲液中，用于透化。然而，结果显示Triton X-100的存在并未导致细胞破裂或裂解，如成像细胞的完整外观所示。这两个方面在染色EVs时需要特别注意，并将在后面进一步讨论。

总体而言，使用GBM CTCs和WBCs获得的双重染色结果表明两种染色颜色之间的串扰可忽略不计，无论它们是用于染色两种不同类型的细胞还是同一细胞上的两种标志物组合，突出了使用开发的TSA技术对细胞进行多重染色的可能性。

3.2 EVs的表征及其在玻璃基底上捕获的优化

正如先前在细胞上证明的那样，与使用荧光标记一抗或二抗的传统染色策略相比，开发和呈现的TSA技术显示出显著的优势，包括（a）最小的非特异性染色，（b）荧光信号的放大，（c）高信号动态范围和（d）随时间的高信号稳定性。这些特征在染色单EVs时具有关键重要性，考虑到大多数囊泡的非常小的尺寸（<400 nm）以及许多在癌症中具有重要性的标志物/蛋白质的非常低的丰度。这些特性的组合使得单囊泡染色极具挑战性，因为荧光信号极其微弱或往往在图像采集之前就消失。

在验证和应用开发的TSA染色技术于单囊泡之前，进行了一些初步表征实验以确保从GBM亲代细胞中正确分离EVs。EVs的收集和捕获确实比细胞更具挑战性， due to the small size of these vesicles, their heterogeneity and their overlap in size and density with other particles present in body fluids or cell media, such as protein aggregates or lipoproteins。

使用Izon SEC色谱柱分离后，首先使用NTA表征EVs的尺寸和浓度（图4A），通过ELISA（图4B）、Western Blot（图S2）和dSTORM成像（图4C）验证其蛋白质含量，并通过透射电子显微镜（TEM，图S2）评估其形态。如所示，分离的样品主要包含小EV（sEV）尺寸范围（<400 nm，图4A）的颗粒，浓度范围从0.9×10⁹到4×10⁹颗粒/mL。颗粒显示出通常存在于EVs上的几种标志物，如CD9、CD63、CD81、Alix和HSP70（图4B, C-S2A），以及通过Calnexin absence of cellular contamination（图S2A）。TEM图像显示了在预期EV尺寸范围内的脂质双层囊泡的存在，没有主要污染物，支持分离囊泡的纯度（图S2B）。总的来说，这些表征实验证实了分离样品中EVs的存在。

对于抗体染色实验，囊泡必须牢固且稳定地固定在基底上，以便能够承受多次洗涤循环。为了确定最佳捕获策略，分离和表征后，将EVs固定在不同的基底上，并在各种铺板条件、浓度和洗涤循环后计数。为简单起见，使用从表达tdTomato的GBM细胞中分离的带有串联二聚体Tomato（tdTomato）标记的EVs（称为tdTom-EVs）用于这些实验。具体来说，将囊泡固定在两种不同的包被玻璃载玻片上：Poly-L-Lysine（PLL）和TB380载玻片。此外，我们通过使用 overnight adsorption 或使用离心力（例如，细胞离心）铺板EVs来评估每个表面。两种不同的EV浓度，低EVs = [1×]和高EVs = [8×]，用于所有铺板条件，并在多次PBS洗涤步骤（5-10次）后计数囊泡。如图4D和图S3所示，最好的EV捕获和保留是在TB380载玻片上通过囊泡的 overnight adsorption 获得的。这种策略确保了最高的捕获EVs/FOV平均数量（高EVs约2300个，图S3B），囊泡在基底上的最均匀分布，以及分析的两种不同EV浓度之间的最佳比例（图4D，右图，和图S3B：EV比率[8×]/[1×] = 5.5 for TB380 和 [8×]/[1×] = 1.8 for PLL）。重要的是，被检测为EVs的颗粒的FL强度分布（图S3C）在两种不同的EV浓度之间保持一致，在测试的较高浓度（高EVs [8×]）下没有向更高强度值移动。这一发现表明主要是单个EVs被固定和分析。此外，EVs在基底上保持稳定固定至少3天（图S4）， upon storage of the slide at 4°C。考虑到这些结果，TB380载玻片被用作后续使用开发的TSA技术的EVs实验的基底。

3.3 开发的TSA染色在单EVs上的验证与应用

在初步验证染色技术于细胞上并优化EVs在基底上的捕获后，系统研究了开发的TSA技术用于单囊泡染色的适用性并得到确认。具体来说，从GBM2 CTC系分离的囊泡使用开发的信号放大方法以及两种传统方法（直接染色（DS）和一抗+二抗染色（PSS））在单颗粒水平进行染色。由于这些囊泡缺乏内在荧光，选择表面蛋白CD63作为标志物，并使用荧光标记的抗体和/或TSA探针进行染色。对于这些EVs的染色，遵循了用于GBM CTCs的相同协议（参见材料与方法和支持信息），例外情况是（1）跳过了DAPI步骤，（2）在协议结束时囊泡未干燥， prior to the coverslip mounting, and that (3) a lower concentration of Triton X-100 (0.01% as compared to 0.3% for cells) was included in the diluent buffers。后一项调整是基于脂质膜包裹的囊泡（如EVs）已被证明对去垢剂裂解敏感，因此需要精心选择去垢剂类型和浓度以保持其结构完整性。由于Osteikoetxea等人的一项研究表明0.01% Triton X-100浓度能最好地保存外泌体和微囊泡，该特定去垢剂浓度被采用并整合到我们的EVs染色协议中。

如图5A, D和G所示，所有三种方法都显示出与各自PBS对照（无EVs的基底，用荧光CD63抗体或TSA探针染色）相比的单囊泡特异性染色。然而，通过直接染色方法获得的荧光信号明显弱于其他两种方法，幻觉地显示每个FOV的阳性EVs数量非常少（<100）。鉴于囊泡的铺板浓度在三种不同基底之间相同，如此低的阳性EVs数量，与其他两种方法（其中阳性EVs/FOV >2000）相比，归因于大多数EVs上的CD63信号较弱、相等或并不显著强于基底的背景信号，因此掩盖了囊泡。另一方面，TSA染色方法显示出所有技术中最强的CD63强度，再次证明了荧光信号的所需放大。这种荧光信号的趋势可以在图5B, E和H的图中进一步观察、确认和量化，这些图显示了三种方法下单囊泡CD63强度的分布。可见，DS方法显示出最弱的CD63积分强度（平均强度=95 a.u.）和最低的EV计数/FOV among the three methods, while the TSA approach showed the highest intensities (average intensity = 607 a.u., 6.4× higher than the DS method)。毫不奇怪，PSS方法显示出中间的CD63强度（平均强度=143 a.u., 4.2× lower than the TSA method），但比TSA方法更高的EV计数/FOV（~7500）（~4500）。

当观察荧光信号随时间