揭示EPAC在人房肌细胞中的致心律失常机制：通过CaMKII与AMPK-NOS-PKG信号通路调控K+电流

本文揭示了cAMP直接激活交换蛋白（EPAC）在人房肌细胞中的致心律失常新机制。研究发现EPAC1和EPAC2通过CaMKII和AMPK-NOS-PKG信号通路抑制钾电流（IK），延长动作电位时程（APD），而EPAC1在房颤（AF）患者心房组织中特异性高表达。该研究为AF的机制研究和靶向治疗提供了重要理论依据。

　　

引言

环磷酸腺苷（cAMP）作为 ubiquitous 的第二信使，通过四种直接转导器调节心脏功能。其中，cAMP直接激活交换蛋白（EPAC）家族包括EPAC1和EPAC2两个成员，在心脏中主要以EPAC1为主。EPAC通过催化小GTP酶Rap1和Rap2的GDP/GTP交换，独立于PKA发挥作用。近年来研究发现，EPAC在心律失常发生中扮演重要角色，但其在人房肌细胞中的电生理调控机制尚不清楚。

EPAC激活通过抑制K⁺复极电流延长APD

研究采用膜片钳技术在酶解新鲜分离的人房肌细胞中记录动作电位（AP）和K⁺电流。结果显示，使用EPAC激动剂8-CPTAM（10 μmol/l）急性激活EPAC后，来自窦性心律（SR）患者的心肌细胞AP时程显著延长，这是由于复极K⁺电流受到抑制所致。选择性EPAC1抑制剂AM-001（20 μmol/l）或EPAC2抑制剂ESI-05（25 μmol/l）都能阻止8-CPTAM对AP和I_K的影响，表明两种EPAC亚型都参与了这一电生理调控过程。

两种EPAC亚型共同调控K⁺电流

通过使用特异性抑制剂，研究发现EPAC1和EPAC2都参与K⁺电流的调节。ESI-05预处理略微降低了I_Kpeak，提示EPAC2对I_K的失活部分存在基础性调控。两种抑制剂预处理都显著减轻了8-CPTAM引起的I_Ksus和I_Kpeak变化，证实两种EPAC亚型在人房肌细胞I_K调控中都具有重要作用。

EPAC药理激活抑制三种主要K⁺外向复极电流成分

研究人员使用药理学方法区分了I_to1、I_KUR和I_KDR（I_Kr和I_Ks的总和）。在含有4-AP（750 μmol/l）的细胞外液中，8-CPTAM处理使I_to1降低18.1±6.07%，I_KDR降低14.5±8.3%。使用多非利德（1 μmol/l）和TEA（10 mmol/l）抑制I_KDR后，测得I_KUR被8-CPTAM降低18.6±7.1%。这些数据表明，EPAC药理激活影响了人房肌细胞中三种主要的K⁺外向复极电流。

两条信号通路参与EPAC诱导的心房电生理调控

机制研究表明，EPAC1和EPAC2蛋白对三种主要K⁺电流成分（I_to1、I_KDR和I_KUR）的抑制作用是Ca²⁺非依赖性的，但涉及Ca²⁺/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）和AMP激活蛋白激酶（AMPK）-一氧化氮合酶（NOS）-蛋白激酶G（PKG）轴。使用CaMKII抑制剂AIP_II肽（1 μmol/l）后，EPAC引起的I_Kpeak降低得到缓解，但对I_Ksus的降低没有影响。使用快速Ca²⁺螯合剂BAPTA（10 mmol/l）代替EGTA后，8-CPTAM引起的I_Ksus和I_Kpeak抑制没有改变，表明EPAC介导的K⁺通道抑制不依赖于Ca²⁺增加。

NOS抑制剂L-NAME（1 mmol/l）预处理减少了8-CPTAM引起的I_Ksus降低，但对I_Kpeak的降低没有影响。选择性PKG抑制剂KT5823（1 μmol/l）也阻止了8-CPTAM引起的I_Ksus抑制，但不改变I_Kpeak的降低。这些结果表明NOS/PKG通路参与了I_Ksus的下调，但不参与I_Kpeak的调控。

研究人员使用HL-1房肌细胞系进一步探索了EPAC激活NOS的机制。结果显示，急性8-CPTAM处理没有改变ROS敏感探针DCFDA的荧光强度，表明急性K⁺调控与EPAC激活产生的氧化状态无关。使用选择性Akt抑制剂Akt_VIII（10 μmol/l）没有阻止8-CPTAM对I_Ksus或I_Kpeak的任何影响，而使用AMPK抑制剂dorsomorphin（10 μmol/l）后，EPAC引起的I_Ksus和I_Kpeak下调都得到缓解。Western blot分析显示，急性EPAC激活诱导了eNOS Ser¹¹⁷⁷位点磷酸化的增加，这一效应被AMPK药理抑制所缓解。

EPAC1在房颤发生机制中的作用

蛋白质印迹分析显示，与SR患者相比，AF患者心房组织中EPAC1蛋白水平显著上调，而EPAC2水平在两组中相似。在AF患者心肌细胞中，8-CPTAM应用显著降低了I_Kpeak（从4.35±3.0降至3.84±2.7 pA/pF）和I_Ksus（从4.13±1.7降至3.36±1.5 pA/pF）的电流密度。当在8-CPTAM存在下应用选择性EPAC1阻断剂AM-001（20 μmol/l）时，纠正了EPAC激活对I_Ksus的影响（从3.36±1.5升至3.67±1.6 pA/pF），但对I_Kpeak没有影响，提示EPAC2可能参与峰值成分的调控。

讨论

本研究首次描述了EPAC对心房特异性I_KUR电流的特异性调控。该电流在人心房复极外向K⁺电流中约占70%。EPAC激活通过AMPK-eNOS-PKG通路以及CaMKII信号导通路导致K⁺电流下调。值得注意的是，EPAC1在AF心房中特异性过表达，而EPAC2没有这种变化。

转化意义和局限性

使用人类心房样本具有转化优势，但研究也存在一些局限性。鉴于AF样本数量，没有区分不同类型的AF（阵发性、持续性或永久性）。使用药理学工具阐明EPAC1和EPAC2在K⁺电流调控中的作用时，不能排除选择性和特异性问题。另一个技术限制可能与免疫印迹分析中抗体的使用有关。

结论

本研究显示EPAC蛋白在人房肌细胞中作为电生理调节剂发挥作用。EPAC激活通过下调K⁺复极电流导致AP延长。研究揭示了CaMKII和AMPK-NOS-PKG轴依赖的两条通路的参与。最后，该研究表明AF心肌细胞中EPAC1通路的过度激活可能参与了AF发生基础的细胞电生理重塑。