染色体III非整倍性通过增加TUP1拷贝数增强工业酿酒酵母乙醇耐受性

本研究揭示了染色体III非整倍性通过增加关键转录调控因子TUP1的拷贝数，从而增强工业酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）乙醇耐受性的新机制。研究者通过比较具有不同染色体III拷贝数的菌株在6%和10%乙醇胁迫下的基因表达谱（RNA-seq），并结合靶向基因敲除实验，证实TUP1是调控乙醇应激反应的核心因子。该发现为理解非整倍性在酵母驯化中的作用及优化工业发酵过程提供了重要遗传学见解。

　　

引言

乙醇胁迫是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在发酵过程中面临的重大挑战。乙醇作为一种强效应激原，会抑制细胞呼吸、阻碍生长并导致细胞死亡，同时影响酶活性、破坏膜完整性、诱发活性氧产生并改变碳代谢。尽管酿酒酵母已进化出多种防御机制（如产生热休克蛋白、积累海藻糖、改变液泡形态）来应对乙醇胁迫，但提高其乙醇耐受性仍是生物技术领域的重要目标。工业酿酒酵母菌株（如葡萄酒酵母）通常比野生菌株表现出更高的乙醇耐受性，这是人类数千年酿酒过程中人工选择（即驯化）的结果。

先前研究表明，染色体III的非整倍性（三体性）与乙醇耐受性增强显著相关。染色体重复是生物应对恶劣环境的常见适应性策略，可作为应对突然选择压力的快速但暂时的防御机制。然而，染色体III非整倍性增强乙醇耐受性的具体分子机制尚不清楚。本研究旨在探究其潜在机制，重点关注乙醇胁迫下的基因剂量效应和差异基因表达。

材料与方法

研究所用菌株为S. cerevisiae 2-200-2（MATα/α），该菌株源自FY5（MATα）背景，并删除了FLO1、FLO10和FLO11基因。随后，该菌株在乙醇胁迫下经过200代适应性进化，获得的进化菌株2-200-2表现出超突变表型，并携带染色体III非整倍性以及ASG1和PET123的插入缺失突变。2-200-2-S4是2-200-2的衍生菌株，其一个染色体III拷贝被删除。因此，本研究拥有2-200-2（3xChrIII）和2-200-2-S4（2xChrIII）两种菌株。此外，本研究还在2-200-2背景上创建了TUP1敲除菌株。

菌株在葡萄糖蛋白酵母提取物（GPY）培养基中培养。将菌株接种于含有0%、6%或10%乙醇的GPY培养基中，在28°C、150 rpm振荡培养。分别于接种后1小时和10小时收集细胞样品，用于RNA提取和测序。RNA-seq数据使用Bowtie2比对至S. cerevisiae参考菌株S288C，并使用DESeq2进行差异表达基因（DEGs）分析。进行基因本体（GO）富集分析和通路富集分析。使用同源重组方法敲除2-200-2菌株中的一个TUP1拷贝，并通过qPCR验证拷贝数变化。通过测量菌株在不同乙醇浓度下的生长曲线，计算非抑制浓度（NIC）和最低抑制浓度（MIC），以评估乙醇耐受性。

结果

染色体III非整倍性在乙醇暴露期间驱动细微但一致的表达变化

基因表达水平的PCA分析显示，培养条件和乙醇暴露时间是基因表达的主要决定因素，而非菌株特异性差异。在无乙醇胁迫下，几乎所有的DEGs都位于染色体III上，这很可能是非整倍体菌株中额外的染色体III拷贝所致。然而，乙醇暴露引发了更广泛的转录反应，在3xChrIII和2xChrIII菌株之间观察到大量DEGs。在10%乙醇条件下，1小时和10小时发酵点共享的基因数量最多。为了分离染色体不平衡的影响，研究分别分析了染色体III上的基因和其他染色体上的基因。

乙醇胁迫增加染色体III上乙醇耐受性相关基因的表达

对位于染色体III上的DEGs分析发现，在暴露于10%乙醇10小时后，有50个基因在菌株2-200-2中的表达高于2-200-2-S4。其中5个基因（SPB1、GFD2、ADF1、SRO9和RSA4）的log₂FC > 2，这些基因在核糖体生物发生或翻译调控中起关键作用。只有一个基因YCR024C-A（PMP1）在菌株2-200-2中的表达较低，这表明即使存在额外的基因拷贝，也存在抑制其表达的调控机制。

Tup1p被鉴定为乙醇耐受性基因的关键染色体III调控因子

对具有不同染色体III拷贝数的菌株之间的DEGs进行共享调控模式分析，发现Tup1p-Ssn6p复合物是最突出的候选因子。富集分析显示，YCR084C（TUP1）是唯一一个位于染色体III上的富集转录因子。值得注意的是，Tup1p在耐受菌株（3xChrIII）中在各种乙醇暴露条件下表达均增加。进一步分析表明，近一半（45%）的DEGs受TUP1调控。在这些TUP1调控的DEGs中，log₂FC最高的基因（> 4）包括PHO84、SPB1（位于染色体III上）和HXT12。在10%乙醇存在下出现的DEGs数量最多。

扩增的TUP1表达调控增强乙醇抵抗力的关键代谢途径

对高差异表达基因的KEGG通路富集分析显示，在菌株2-200-2（3xChrIII）中最富集的通路是甾醇生物合成，该通路通过调节质膜流动性有助于乙醇抵抗力，并且已知受TUP1-SSN6调控。三羧酸（TCA）循环通路也高度富集。Tup1p在响应营养可用性调节代谢转换方面起关键作用。其次是卟啉生物合成通路。就受影响基因的数量而言，次级代谢物生物合成是最富集的通路，其次是减数分裂、细胞周期、氨基酸生物合成和碳代谢。这些通路中包含许多受TUP1调控的DEGs。

降低TUP1拷贝数凸显其在乙醇耐受性中的关键功能

为了研究TUP1拷贝数在乙醇耐受性中的作用，研究者通过同源重组从菌株2-200-2中删除了一个TUP1拷贝。qPCR分析证实，所得突变体2-200-2ΔTUP1的TUP1正常拷贝数为2/3，表明成功删除了一个拷贝。乙醇耐受性测定显示，与菌株2-200-2相比，2-200-2ΔTUP1突变体的NIC和MIC值降低，其水平与菌株2-200-2-S4相当。这些发现表明，染色体III上TUP1拷贝数的增加有助于增强乙醇耐受性。

讨论

乙醇耐受性是一个复杂的性状。本研究比较了具有相同遗传背景但染色体III拷贝数不同的两种菌株的表达谱，从而分离了额外染色体拷贝的影响。在无乙醇的正常条件下，两菌株间基因表达差异极小。然而，暴露于高（10%）和低（6%）乙醇浓度时，出现了显著的基因表达和激活机制的差异。10%乙醇引发的差异表达基因数量远多于6%乙醇。

本研究的一个关键发现是，染色体III上TUP1拷贝数的增加影响了许多先前已被证明与乙醇耐受性相关的基因的表达，包括膜组成、碳代谢和细胞周期相关的基因。TUP1是一个保守的转录共抑制子，受葡萄糖耗尽调控，并在去乙酰化过程中起关键作用。值得注意的是，Tup1p-Ssn6p复合物在酿酒酵母中扮演双重角色，根据细胞条件既可作为抑制子也可作为激活子。在正常条件下，Tup1p主要作为抑制子，沉默涉及碳水化合物代谢、转运和应激反应等多种过程的基因。在胁迫条件下，包括乙醇或渗透胁迫，Tup1p的功能发生转变，细胞经历基因表达的复杂重组，其特征是胞质核糖体复合物相关基因的激活增加。同时，细胞表现出糖转运蛋白的差异调控，以适应乙醇胁迫水平。

总之，本研究揭示了在乙醇胁迫下经过200代适应性进化后出现的2-200-2菌株的染色体III非整倍性，提出了一种以转录因子TUP1为核心的乙醇耐受性机制。TUP1的拷贝数显著影响乙醇耐受性。乙醇耐受菌株表现出染色体III拷贝数增加，可能放大了TUP1的表达。这种染色体重复是对突然、强烈选择压力的初始进化反应。TUP1通过SUMO化在激活子和抑制子角色之间快速转换的能力，使其能够快速适应不断变化的环境。尽管TUP1是一个通用的应激调控因子，但本研究强调了其在乙醇耐受性中的特定重要性。研究者在乙醇耐受菌株中鉴定出大量在高乙醇浓度下受TUP1差异调控的基因，强调了其在协调细胞对乙醇胁迫反应中的关键作用。这些全面的证据强调了染色体重复、基因调控和TUP1介导的适应性反应在乙醇耐受性中的复杂相互作用，为了解酵母应激抵抗的进化提供了见解。